Разработка способа индикации и идентификации Vibrio parahaemolyticus с помощью real-time ПЦР

Vibrio parahaemolyticus – грамотрицательная галофильная бактерия, встречающаяся в природе в морских и эстуарных водах и часто изолируемая из различных морепродуктов – устриц, креветок, крабов, лобстеров, омаров, раков, рыбы (треска, сардина, скумбрия, камбала), осьминогов, гребешков и замороженных морепродуктов во многих странах мира [Spanggaard et al., 2000; Hara-Kudo et al., 2001; Deepanjali et al., 2005]. Этот возбудитель вызывает заболевание по типу острого гастроэнтерита, характеризующегося тошнотой, рвотой, спаз- мами в животе, диареей [Chakraborty, Nair, Shinoda, 1997; Daniels et al., 2000]. Выявлена взаимосвязь обсемененности вибриофлорой воды и рыбы с заболеваемостью людей. Заражение людей происходит при употреблении в пищу некачественно приготовленных продуктов моря. Так, установлено, что последние годы в Астраханской обл. острые кишечные инфекции, обусловленные вибрионами, составляют около 14% всех диарей. В районах промысла дельты р. Волги различные вибрионы были выделены из судака, осетра, белуги, стерляди. Заболевания, вызываемые парагемоли-тическими вибрионами и связанные с употребле-

нием в пищу морепродуктов, регистрируются на побережье Черного и Азовского морей [Домниц-кий, 2016]. В 2012 г. была зарегистрирована вспышка пищевой токсикоинфекции, вызванной V. parahaemolyticus в Хасанском р-не Приморского края.

Успех лечебно-профилактических и санитарноэпидемиологических мероприятий, направленных на предотвращение распространения «галофиле-зов», во многом зависит от своевременной точной идентификации штаммов вибрионов, выделяемых от больных, из морепродуктов, а также при мониторинге объектов окружающей среды.

В настоящее время существует большое количество микробиологических методов детекции, основанных на культивировании, выделении чистых культур и биохимической идентификации этих вибрионов [Лабораторная …, 2004]. Сложность идентификации и дифференциации парагемолити-ческих от других близкородственных видов вибрионов традиционными методами обусловлена их большим фенотипическим сходством, вариабельностью признаков и, как следствие, небольшой относительной диагностической ценностью отдельных таксономических тестов.

Молекулярно-генетические методы находят широкое применение, как для идентификации культивируемых микроорганизмов, так и для детекции специфических групп бактерий. Для быстрой идентификации V. parahaemolyticus успешно применяется метод MALDI-ToF масс-спектрометрии; однако, не все лаборатории оснащены необходимым оборудованием [Чемисова и др., 2013; Полеева, Чемисова, 2018].

Методы диагностики бактериальных инфекций на основе видоспецифичной полимеразной цепной реакции (ПЦР-диагностика) показали свое преимущество перед классическими микробиологическими методами [Белькова, Дзюба, Суханова, 2009] и могут стать основой молекулярногенетического мониторинга ассоциированной микрофлоры водных организмов. Они требуют меньшего времени и эффективны в детекции конкретных патогенов на всех стадиях заболевания. ПЦР-диагностика позволяет корректно идентифицировать микроорганизмы, культивирование и определение которых по классическим биохимическим тестам затруднительно. Эти методы активно используются в странах с развитой аквакультурой, постоянно совершенствуются и развиваются [Buller, 2004; Белькова и др., 2010].

В последние годы широкое распространение получил метод идентификации микроорганизмов с помощью полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR), преимуществами которого являются объединение этапов амплифика- ции и детекции, что упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации, позволяет проводить количественный учет результатов, обеспечивает высокую специфичность и чувствительность анализа [Ребриков и др., 2009].

Ранее зарубежными авторами, были выявлены видоспецифичные для V. parahaemolyticus участки ДНК и разработаны методы идентификации с помощью ПЦР с электрофоретическим способом учета результатов [Di Pinto, Ciccarese, Tantillo, 2005; Luan et al., 2007; Reham, Amani, 2012; Li et al., 2016]. Однако учет результатов реакции с помощью электрофореза требует дополнительного времени, организации отдельной рабочей зоны в связи с повышенным риском контаминации. Эти обстоятельства усложняют использование метода ПЦР с учетом результатов с помощью электрофореза в геле. Метод Real-Time ПЦР лишен этих недостатков. На сегодняшний день в Российской Федерации отсутствуют зарегистрированные олигонукле-отидные праймеры и зонды для видовой идентификации вида V. parahaemolyticus , а существующие зарубежные тест-системы являются дорогостоящими для широкого применения в лабораторной практике.

Цель данной работы – разработка способа индикации и идентификации микроорганизмов вида V. parahaemolyticus при исследовании проб биологического материала (рыба, морепродукты) на основе метода полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-Time PCR).

Материалы и методы исследования

В работе были использованы штаммы V. parahaemolyticus (100 штаммов) из коллекции Музея живых культур ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора, а также коллекционные штаммы других видов рода Vibrio – V. alginolyticus (25 штаммов), V. fluvialis (10 штаммов), V. hollisae (5 штаммов), V. vulnificus (10 штаммов), V. harvey (5 штаммов), V. mimicus (5 штаммов), V. furnisii (5 штаммов) и V. fortis (2 штамма).

Для анализа нуклеотидной последовательности ДНК V. parahaemolyticus была использована база данных GeneBank. Для поиска уникальных последовательностей специфического гена были использованы ресурсы GeneBank-on-line Blast. Для конструирования праймеров и зонда было применено программное обеспечение PrimerM (ФКУЗ Ростов-ский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора) и BLAST NCBI.

Синтез сконструированных нами праймеров и зонда был осуществлен компанией «Синтол» (г. Москва). Для проведения амплификации использована коммерческая стандартизированная реак- ционная смесь для проведения ПЦР в режиме «реального времени» компании «Синтол» (г. Москва). Амплификацию и флуоресцентную детекцию проводили на автоматическом детектирующем термоциклере «ДТ-Lite» (ДНК-технология, Россия), в режиме «реального времени».

Подготовка материала для исследования

• 1.    Штаммы микроорганизмов. Суточные агаровые культуры суспендировали в дистиллированной воде до 1×10⁹ микробных клеток в 1 мл (м. кл./мл) и обеззараживали прогреванием при 100ºС в течение 30 мин., согласно МУ 1.3.2569-09 [МУ 1.3.2569-09, 2010]. Затем дебрис осаждали центрифугированием при 10 тыс. об/мин в течение 5 мин. и использовали супернатанты в качестве ДНК-матриц при ПЦР.

• 2.    Образцы тканей рыбы (судака), искусственно контаминированной бактериями V. parahaemoly-ticus . В исследование брали кусочки кожи с чешуей и мышцами. Навеску массой 1 г измельчали и тщательно растирали в стерильной ступке с 2–3 г стерильного кварцевого песка. Добавляли 10 мл забуференного физиологического раствора, тщательно перемешивали. Затем к гомогенату добавляли 0.1мл микробной взвеси V. parahaemolyticus , содержащей 10⁹–10³ м. кл./мл согласно стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Тщательно перемешивали и давали отстояться приготовленной смеси 20 мин. при комнатной температуре. Затем через стерильный тампон отбирали пробу (надосадочную жидкость) объемом 0.5 мл и использовали в качестве ДНК-матриц при ПЦР.

• 3.    При использовании бактериальных взвесей с концентрацией 10⁴–10¹ м. кл./мл проводили дополнительное обогащение в 1%-ной пептонной воде с 2%-ным NaCl в течение 8 ч. Контроль количества клеток проводили бактериологическим высевом на плотную питательную среду с последующим подсчетом колоний. ПЦР ставили через 2, 4,

• 6, 8 ч. выращивания в среде обогащения.

Выделение ДНК проводили с помощью комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В», согласно прилагаемой инструкции. В качестве контроля реакции использовали бактериальные взвеси в концентрации 10⁹–10³ м. кл./мл согласно стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича.

Приготовление реакционной смеси для ПЦР . Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей: буферный раствор для ПЦР в реальном времени; 0.25 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов; 1 ед. Taq-полимеразы с функцией «горячего старта»; 2.5 мМ хлористого магния; 50 пкМ каждого праймера; 50 пкМ зонда и 20 нг хромосомной ДНК одного из исследуемых образцов.

Амплификация . Постановку реакции амплификации в автоматическом детектирующем ам-плификаторе ДТ-Lite (ДНК-технология, Россия), в котором были заданы следующие условия: первичной денатурации и активация Taq-полимеразы (94°С, 15 мин.), 35 циклов, включающих этапы 94°С, 30 с.; 55°С, 30 с. (детекция) и 72°С, 30 с.

Детекция флуоресценции производится автоматически в ходе проведения ПЦР с помощью детектирующего амплификатора. При наличии в исследуемой пробе ДНК гена металлопротеазы (коллагеназы) вида V. parahaemolyticus с помощью используемой пары специфических праймеров гибридизируется зонд, так как является комплементарным ему (фрагменту), а последующее разрушение зонда Taq-полимеразой приводит к началу флуоресцентного свечения флуорофора ROX с длиной волны 605 нм, которое регистрируется прибором. Учет детекции флуоресцентного свечения по соответствующей длине волны в амплифи-каторе отражается на мониторе компьютера, связанного с прибором, в виде графиков, на которых представлены кривые и численные значения, отражающие уровни флуоресцентного свечения определенной длинны волны, соответствующие каждой пробе, взятой для исследования.

Результаты и их обсуждение

С помощью программного обеспечения PrimerM (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора) и BLAST NCBI был проанализирован участок гена металлопротеа-зы (коллагеназы), в результате чего определен специфический фрагмент гена, который был использован в качестве мишени для конструирования специфического зонда, комплементарного соответствующей последовательности ДНК. Зонд имел следующую структуру: vppCProbaA (ROX-CG-TTC-ACA-ACC-ACC-AAC-AGC-AAC-GAC-TTG-BHQ2). Зонд комплементарен специфическим продуктам ПЦР, гибридизуясь с ними и впоследствии разрушаясь под воздействием ДНК-полимеразы во время ферментативной реакации, что приводит к началу флуоресцентного свечения флуорофора, связанного с зондом. Данный специфический зонд vppCProbaA содержит в своем составе флуоресцентную метку ROX, гаситель флуоресценции BHQ2.

Для амплификации в ПЦР фрагмента ДНК, содержащего мишень для зонда и в соответствии с нуклеотидной последовательностью зонда, были сконструированы и синтезированы специфичные для вида V. parahaemolyticus праймеры:

– праймер vppCFor (CGG-CAA-GCG-TGG-TTT-GTG-AC);

– праймер vppCRev (CGT-TGA-TGC-AAC-TTG-CAC-CTT-G).

Был получен патент на изобретение «Способ идентификации штаммов вида Vibrio parahaemolyticus методом ПЦР в режиме реального времени № 2644232 от 8 февр.2018 г.

При апробации предложенного способа на коллекционных штаммах V. parahaemolyticus с точно установленной видовой принадлежностью и штаммах видов V. alginolyticus , V. fluvialis , V. hollisae , V. vulnificus , V. harvey , V. mimicus , V. furnisii и V. fortis , разработанные праймеры и зонд показали 100%-ную специфичность по отношению к штаммам V. parahaemolyticus (таблица).

Результаты идентификации клинических штаммов V. parahaemolyticus методом Real-Time ПЦР

Вид микроорганизма	Число ис-следованных штаммов	Результаты ПЦР
		число положи-тельных проб	число от-рица-тельных проб
V. parahaemolyticus	100	100	0
V. alginolyticus	25	0	25
V. fluvialis	10	0	10
V. hollisae	5	0	5
V. vulnificus	10	0	10
V. harvey	5	0	5
V. mimicus	5	0	5
V. furnisii	5	0	5
V. fortis	2	0	2

Флуоресцентный сигнал с длиной волны 605 нм, характерной для флуорофора Rox, детектировался в ПЦР выше порогового значения тогда, когда пробы содержали ДНК парагемолитических вибрионов, и не детектировался в случае содержания в пробах ДНК других представителей рода Vibrio (таблица). При исследовании чистых культур бактериальных суспензий положительный результат нами наблюдался при концентрации клеток 10⁹–10⁵ м. кл./мл. При этом наблюдалась зависимость количества клеток и номера цикла (начала реакции): 15-й цикл при 10⁹ м. кл./мл и 29-й при 10⁵ м. кл./мл. (рисунок).

Таким образом, в результате проведенной нами работы были сконструированы специфичные праймеры и зонд к ДНК гена металлопротеазы (коллагеназы) V. parahaemolyticus . Были подобраны оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции с выбранной парой праймеров и флуоресцентным зондом в режиме «реального времени». Использование предполагаемого способа выявления специфического участка ДНК гена металлопротеазы (коллагеназы) V. parahae-molyticus с помощью ПЦР в режиме «реального времени» позволит быстро, точно и эффективно проводить идентификацию представителей вида V.

parahaemolyticus и дифференцировать их от близкородственных видов.

Следующим этапом нашей работы было определение возможности использования сконструированных нами праймеров для индикации штаммов V. parahaemolyticus в биологическом материале. Для этого использовали пробы рыбы, искусственно контаминированные бактериями V. parahae-molyticus. В результате наблюдали наличие флуоресценции по каналу ROX в пробах, содержащих (с учетом разведений) 10⁷–10⁵ м. кл./мл. При этом реакция начиналась позже, чем при постановке ее с чистой культурой микроорганизмов: 10⁷ – 27-й цикл, 10⁵ – 31-й цикл (рисунок).

Зависимость флуоресценции канала ROX и номера цикла от состава пробы:

• 1    – концентрация клеток чистой культуры V. para-haemolyticus 10⁹ м. кл./мл; 2 – концентрация клеток чистой культуры V. parahaemolyticus 10⁵ м. кл./мл; 3 – концентрация клеток V. parahaemolyticus в контаминированной пробе рыбы, 10⁷ м. кл./мл; 4 – концентрация клеток V. parahaemolyticus в контаминированной пробе рыбы, 10⁵ м. кл./мл; 5 – положительный контроль; 6 – отрицательный контроль

Проведенные нами исследования показали возможность использования полученных праймеров, специфичных последовательности генов металло-протеазы (коллагеназы) – vppC V. parahae-molyticus, для индикации парагемолитических вибрионов в зараженных пробах рыбы. Чувствительность реакции составила 10⁵ м. кл. в 1 г зараженного продукта.

При изучении возможности использования среды обогащения (1%-ная пептонная вода с 2%-ным NaCl) для накопления культуры в пробах, содержащих V. parahaemolyticus в количестве 101–104 м. кл./мл было показано, что после «подращивания» проб, изначально содержащих 104 м. кл./мл, в течение 4 ч. в среде обогащения количество колоний на плотной агаровой среде составило 105 м. кл./мл; пробы, изначально содержащие 101 м. кл./мл, достигли концентрации 105 м. кл./мл через 8 ч. выращивания в среде обогащения. После проведения ПЦР в режиме «реального времени» через 8 ч. выращивания наблюдали наличие флуоресценции по каналу ROX в пробах, изначально содержащих 101 м. кл./мл.

Использование метода Real-Тime ПЦР с предложенными нами праймерами, позволяет существенно повысить достоверность ПЦР-анализа, исключив возможность контаминации; сократить трудозатраты и время анализа, задействовав в аналитическом процессе минимум сотрудников; проводить ПЦР-анализ в одном помещении, что играет существенную роль для лабораторий, занимающихся исследованиями объектов рыбного промысла.

Выводы

Набор полученных нами олигонуклеотидов, включающий прямые, обратные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, сконструированные на основе фрагментов гена металлопротеазы (коллагеназы), специфичного V. parahaemolyticus , позволяет методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени выявлять ДНК возбудителей V. pa-rahaemolyticus в исследуемом материале.

Применение разработанного набора реагентов для идентификации штаммов вида V. parahaemo-lyticus методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR) при исследовании проб биологического материала и объектов окружающей среды позволяет обнаружить и дифференцировать ДНК возбудителей V. parahaemolyticus с аналитической чувствительностью от 1×10⁵ м. к./мл и аналитической специфичностью – 100%.

Предварительное обогащение проб в 1%-ной пептонной воде с 2%-ным NaCl в течение 8 ч. позволяет выявлять бактерии V. parahaemolyticus при исходной концентрации их в пробе 10¹ м. кл./мл методом Real-Time PCR.