Разработка способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина

Основной задачей молочного скотоводства является получение высокопродуктивных животных, дающих молоко с большим содержанием белка и обладающее хорошими технологическими свойствами. Однако селекционная работа, построенная на традиционных подходах, имеет, небольшой селекционный эффект. В настоящее время, с развитием молекулярной генетики и биологии, становиться возможным идентификация огромного числа генов. Выявление предпочтительных с точки зрения селекции генотипов позволит дополнительно к традиционному отбору животных проводить селекцию непосредственно на уровне ДНК [2].

В связи с тем, что ген каппа-казеина

( CSN3 ) однозначно ассоциируется с признаками белковомолочности и технологическими свойствами молока у крупного рогатого скота [3, 1], исследования, касающиеся этого гена являются актуальными. Наши исследования заключались в разработке способа АС-ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 .

Материал и методика исследований. Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na 2 , осуществлялась сорбционным способом (коммерческий набор «ДНК-сорб В», производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Генотипирование крупного рогатого скота по гену CSN3 проводили методом АС-ПЦР. ПЦР проводили на программируемом 4-канальном амплификаторе «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащий буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5); 1,5 мМ MgCl 2 ; 25 мМ KCl; 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100); 0,25 мМ dNTP; 1,0 ед. Taq ДНК полимеразы; по 1,0 мкМ праймеров A-F-d: 5 ^/ -GGGGGCTGTTCACACACAAAAACAGTAGAG-3 ^/ , A-R-d: 5 ^/ -GGGGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTCCG-3 ^/ , B-F-d: 5 ^/ -CCCCCGTGAGCCTACAAGTACACCTACGAT-3 ^/ , B-R-d: 5 ^/ -CCCCCGAT-GTCTCCTTAGAGTATTTAGCCC-3 ^/ , все реактивы производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и 1 мкл ДНК-пробы. Режим был следующий:

×1: 94 ⁰ С – 4 мин; ×40: 94 ⁰ С – 30 сек, 72 ⁰ С – 30 сек;

×1: 72 ⁰ С – 7 мин; хранение: 4 ⁰ С

Детекцию результатов АС-ПЦР осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей             визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ = 310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Результаты собственных исследований. К одним из подходов к оценке аллельного полиморфизма гена CSN3 крупного рогатого скота относится изобретение «Способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина» (Р.Р. Вафин и др., 2008), являющееся ближайшим аналогом предлагаемого способа.

Нами разработан способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3, включающий подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, 4х аллель-специфичных праймеров; проведение ПЦР; детекцию амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза; отличающийся от ближайшего аналога изобретения тем, что, используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров, имеющие дополнительные некомплементарные ни к одному из аллелей гена CSN3 «mismatch-нуклеотиды» в позиции –2 от 3/-терминальных нуклеотидов праймеров.

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 , нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации генотипов ввиду корректной интерпретации генерируемых аллель-специфичных ПЦР-продуктов (рисунок 1), сопоставимых с расчётными данными (рисунок 2).

Рисунок 1 – Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3

Обозначения:

М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим);

1-2) генотип AA гена CSN3 кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 242 bp);

3-4) генотип AB гена CSN3 кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 242/156 bp);

5-6) генотип BB гена CSN3 кр.рог.ск. (ПЦР-продукт = 156 bp).

Query	Bos taurus kappa casern (CSN3) gene, CSN3-A allele (A/N: AY380228)
Sbict	Bos taurus kappa casern (CSN3) gene, CSN3-В allele (A/N: AY380229)
Query	13021	TAGTGGTGAGCCTACAAGTACACCTACCACCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCT	13080
Sbict	13017	HP	1307 6
		Место посадки праймера В —F —d
Query	13081	A^AAGATTCTCCA^^TTATTCA^^CCACCT^GATCAACAC^TCCAaGrTACTTC	13140
Sbjjct^	„13077	■^____________________________________________________________________________________________________________________________________	13136
Query	13141	AACTGCAGTCTAAAAACTCTAAGGAGACATCAAAGAAGACAACGCAGGTAAATAAGCAAA	13200
Sbict	13137	------G-------T-------------------------------------------------	13196
		Место посадки праймера В—R—d
Query	13201	AT GAATAAC AGCCAAGATTCATGGAC TT ATT AAT AAAAT C GT AACAT С TAAAC TAGCG TA	13260
Sbict	131 97	------------------------------------------------------------	13256
Query	132 61	GATGGATAAATTAAATCTGTTACAGAGAAGGCGAAATGGGCTAATTATAACTTACATTTG	1332 0
Sbict	13257	------------------------------------------------------------	13316
Query	13321	С T GG T ТС TT TAT C AT GTATATAC TAG AT T СТ T ТС CC AAC AAG AAAGT T TT AAAAT ATT T T	13380
Sbict	13317	------------------------------------------------------------	1337 6
Query	13381	ACAAAATGAGTAAAAATTGCAGATTTTATTATTAAACCTTTTTCAACAATTGGTATACTC	1344 01
Sbict	13377	............................................................	13436
		Место посадки праймера A—F—d
Query	13441	С T TGAAT CTATT AGT TT TAT T TT ACT ТС T GT T CACAC AC AAAAAC AGT AAAGT AC AGT GT	13500
Sbict	13437	-------------------------------c-----------------------------a---------	13496
Query	13501	CAACTCATGATTTTTCTTATCTCAAAAATATGTTTTCTTAGAAAAAAATCATATAGGATA	13560
Sbict	134 97	------------------------------------------------------------	1355 6
Query	13561	T GAGT TTAAATAT AT TT TAAT TG T AT AC С AGT GT TGTTGCAC ТС TAC T TTTGGTAAGAAT	13620
Sbict	13557	............................................................	1361 6
Query Sbict	13621 _JL3617	Место AGAATGAAA.GGAAACAATGTTTCACTCA.TAGCATTTTATCTCAGGCA.TCACTT CCGAAAG	13 680 13676
		посадки праймера A—R—d
Query	13681	GCTGTATAAGGTTAGGCACCCAAA 13714
Sbict	1367 7	.A...................... 13710
Переч<	:НЬ ОЛИГ	онуклестидных праймеров:
A-F-d	5,-GGGGGCTCTTmCACACAAAAACAGTAGAG-3/(30 H. )
A-R-d:	5/-GGGGGGTGCCTAA.CCTTATA.CAGCCTTCCG-3/ (30 H. ) (3'-CGS»AGGCTGTATAAGGTTAGGCACCCCCC-5>)
B-F-d.	S''-CCCCCGTGAGCCTACAAGTACACCTACGAT-3/ (30 H. )
B-R-d;	5/-CCCCCGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGCCC-3/ (30 H. ) (3' -CGTCTAAATACTCTAACGAGACATCSGGCG-5Z)
Ин т ерпр e тация		ПЦР—продуктов:
242 bp = гено		тип АА гена CSN3
156 bp = гено		тип ВВ гена CSN3
242/156 bp =		генотип АВ гена CSN3

Рисунок 2 – Участки посадки праймеров, используемых для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и B гена CSN3 предложенным способом проведения аллель-специфичной ПЦР

Вывод. Разработанный способ приемлемым и эффективным способом проведения аллель-специфичной ПЦР с генотипирования гена каппа-казеина. протоколом 2-х стадийной ПЦР является

ЛИТЕРАТУРА: 1. Ахметов, Т.М. Молочная продуктивность коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина / Т.М. Ахметов, С.В. Тюлькин, Э.Ф. Валиуллина // Ученые записки КГАВМ. – Том. 207. – Казань, 2011.– С. 51-57.          2.

Зиннатова, Ф.Ф. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина (CSN3) у коров холмогорской породы татарстанского типа / Ф.Ф. Зиннатова, А.М. Алимов, Ф.Ф. Зинатов // Учёные записки Казанской ГАВМ. – 2010. – Т. 204. – С. 93-98. 3. Калашникова, Л.А. Влияние полиморфизма генов молочных белков и гормонов на молочную продуктивность коров чёрно-пёстрой породы / Л.А. Калашникова, Я.А. Хабибрахманова, А.Ш. Тинаев // Доклады РАСХН. – 2009. - № 3. – С. 49-52. 4. Патент РФ на изобретение № 2337141 Способ проведение аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина / Р.Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, Р.Р. Вафин. – Приоритет изобретения 25.09.2006. – Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 27.10.2008. – Бюл. № 30.

Тюлькин С.В., Муратова А.В., Хатыпов И.И., Ахметов Т.М., Равилов Р.Х., Вафин Р.Р.

Резюме

Целью данной работы являлась разработка способа генотипирования крупного рогатого скота по гену CSN3 на основе аллель-специфичной ПЦР. Полученные результаты АС-ПЦР гена CSN3 крупного рогатого скота с разработанными праймерами являются удовлетворительными в плане точности идентификации генотипов.

AN INVENTION OF CATTLE GENOTYPING MEANS BY KAPPA-CASEIN GENE OF ALLELESPECIFIC PCR FOR ALLELES A AND B

Tyulkin S.V., Muratova A.V., Khatipov I.I., Ahmetov T.M., Ravilov R.H., Vafin R.R.