Разработка стратегии индукции АОХ1 промотора при культивировании метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii

Дрожжевые системы экспрессии, в том числе Komagataellaphaffii способны к эффективной секреции рекомбинантных белков непосредственно в культуральную жидкость, что значительно облегчает последующие стадии очистки целевых белков от сопутствующих примесей и вторичных метаболитов [1, 7, 15].

Наибольший уровень секреции рекомбинантных белков при культивировании Komaga-taellaphaffii , до 30% от тотальной фракции белка достигается при метанольной индукции гетерологичных генов, клонированных под контролем АОХ1 промотора, однако точный механизм регуляции промотора АОХ1 до сих пор не изучен [2, 5, 8].

Важно отметить, что АОХ1 промотор репрессируется в присутствии глюкозы или глицерина, что позволяет разделить процесс культивирования на стадию набора биомассы (при наличии в среде репрессирующего источника углерода) и стадию синтеза целевого белка (при наличии в среде метанола) [3, 6, 11, 19].

Цель работы – разработка оптимальной стратегии метанольной индукции АОХ1 промотора Komagataellaphaffii .

Результаты и обсуждение

В ходе выполнения настоящей работы исследована скорость роста биомассы и потребления глицерина, при культивировании Komagataella phaffii в лабораторном ферментере Infors Minifors ( Швейцария ) на жидкой питательной среде BSM (Basal Salt Medium) при следующих параметрах: температура 30 ± 0,1 ºС; рН 6 ± 0,2; скорость вращения мешалки 900 ± 10 об/мин; скорость подачи воздуха 1,7 ± 0,05 л/л/мин; давление 0,05 ± 0,01 МПа.

В процессе культивирования обеспечивалось поддержание концентрации глицерина в диапазоне от 0,5 до 2%, за счет периодического внесения подпиточного раствора, содержащего глицерин и микроэлементы PTM. Избыток источника углерода обеспечивает длительную Log-фазу, характеризующуюся линейной скоростью роста биомассы [4, 9, 10]. В результате чего была определена удельная скорость роста Komagataella phaffii и составила 0,24 ч^-1.

Расчет удельной скорости роста Komagataella phaffii проводился по формуле:

X – X

^ =      0Х

X 0 ( t 1    t 0 )

где µ – удельная скорость роста, ч^-1; Х 0 – начальная концентрация биомассы, г/л; Х 1 – конечная концентрация биомассы, г/л; t 0 – начальный момент времени, ч; t 1 – конечный момент времени, ч.

Удельная скорость роста, ч-1

Рисунок 1. Удельная скорость Komagataella phaffii

Figure 1. Specific growth rate Komagataella phaffii

Также проведен расчет удельной скорости потребления глицерина, которая составила 36,99 мг/г×ч. Однако важно учитывать, что скорость потребления глицерина может варьироваться в достаточно широком диапазоне. Рассчитанный показатель устанавливает максимальную скорость потребления глицерина. При этом потенциал роста биомассы ограничивается не исчерпанием питательных веществ, а недостатком растворенного кислорода, при достижении концентрации биомассы более 300 г./л (в пересчете на влажную биомассу). Недостаток кислорода объясняется спецификой массообменных характеристик в заданных условиях ведения процесса [12, 20].

Исследование влияния массовой доли метанола на жизнедеятельность Komagataella phaffii проведено путем культивирования штамма на среде BSM в колбах, с градиентной концентрацией метанола, в диапазоне от 0,2% до 3,6% с шагом 0,2%. Установлено, что при накоплении метанола в культуральной среде более 2% наблюдается значительное снижение скорости роста культуры, что наглядно отражено

Methanol concentration, %

Рисунок 2. Влияние концентрации метанола на прирост биомассы Komagataella phaffii

Figurе2. Effect of methanol concentration on Komagataella phaffii biomass growth

Полученные данные также свидетельствуют о том, что при концентрации метанола менее 0,6% наблюдается снижение скорости прироста биомассы, что вероятно, связано с лимитирующим количеством метанола в среде, в связи с чем особенно важно поддерживать оптимальную концентрацию метанола. Для поддержания оптимальной концентрации метанола был проведен расчет потребления метанола Komagataella phaffii при культивировании в лабораторном ферментере Infors Minifors ( Швейцария ), полученные результаты отражены на рисунке 3.

Q о]

О О СЦ

• сл О

Время культивирования, ч | Time. h

Концентрация метанола % концентрация биомассы г/л

Концентрация pO2, %

Рисунок3. Динамика потребления метанола

Figurе 3. Dynamics of methanol consumption

Полученные данные свидетельствуют о том, что скорость потребления метанола в процессе культивирования варьируется в зависимости от физиологического состояния культуры, наличия или отсутствия определенных компонентов среды и накопления целевого продукта в диапазоне от 0 до 11,256 мкл/ч/г [13, 18].

Расчет скорости потребления метанола Komagataellaphaffii проводился по формуле:

S – S *10

иМ=—---0---х 1000.

C*t где μM – скорость потребления метанола, мкл/ч/г; S0 – начальная концентрация метанола, %; Sx – конечная концентрация метанола, %;

• 10 – коэффициент пересчета% в мл/л; C – средняя концентрация биомассы, г/л; t – время исследования, ч; 1000 – коэффициент пересчета в мкл/г.

При этом из рисунка 3 видна прямая зависимость между массовой долей метанола в среде и концентрацией растворенного кислорода, рО2, в следствии чего в ПО Irisstandart была разработана рецептура внесения метанола на основании показаний датчика рО2, в соответствии с которой при достижении концентрации растворенного кислорода в среде 20% и менее активировался перистальтический насос со скоростью не менее 3 мл/ч на литр среды, до момента достижения концентрации рО2 80%, но не более 20 мл/ч. Полученные данные представлены на рисунке 4.

Время культивирования, ч | Time, h Концентрация метанола % концентрация биомассы г/л Концентрация pO2, %

Рисунок 4. Апробация стратегии внесения метанола

Figurе 4. Testing the methanol application strategy

Также в ходе выполнения настоящей работы проведено исследование зависимости эффективности синтеза целевого белка от концентрации биомассы на момент начала индукции. Исследование проводилось в диапазоне начальных концентраций биомассы от 100 до 300 г./л. В ходе выполнения работы установлено, что оптимальной концентрацией биомассы на момент начала внесения индуктора является 150 ± 10 г./л [14, 16, 17]. Полученные данные представлены в таблице № 1.

Таблица 1.

Концентрации биомассы на момент начала индукции

Table 1.

Biomass concentrations at the start of induction

Концентрация биомассы, г/л Biomass concentration, g/l	Концентрация целевого белка, г/л Target protein concentration, g / l	Концентрация биомассы, г/л Biomass concentration, g/l	Концентрация целевого белка, г/л Target protein concentration, g / l
101,7	0,96	201	1,03
120,4	1,23	221,4	0,86
142	1,74	243	0,53
160,6	1,85	262,3	0,32
179,7	1,37	278,9	0,18
300,3	0,13

Концентрация биомассы на момент начала индукции более 160,6 г/л приводит к снижению времени индукции за счет более быстрого достижения состояния дефицита кислорода и отмирания биомассы, что сокращает длительность стадии индукции и как следствие приводит к снижению выхода целевого белка. При концентрации биомассы на момент начала индукции менее 142 г./л также наблюдается снижение выхода целевого белка, что наиболее вероятно связано с неэффективным использованием компонентов питательной среды ввиду недостаточности концентрации биомассы, а также увеличением общего времени видения процесса, что также приводит к повышению отмирания биомассы и дополнительным механическим повреждениям.

На основании полученных данных и ранее полученных значениях удельной скорости потребления метанола (19,2 ± 1,8 мг/г×ч), получена формула расчета требуемого количества метанола:

M = X0qm (1) 1000Vk где Х0 – начальная концентрация биомассы, г/л; qm – удельная скорость потребления метанола, мг/ г×ч; V – рабочий объем питательной среды в ферментере, л; kt – периодичность внесения индукционного раствора, ч-1; 1000 – перевод в г/г×ч.

Важно отметить, что индукция АОХ1 промотора и как следствие синтез целевого белка начинается только после исчерпания в среде глицерина. При этом перестройка метаболизма с глицерина на метанол занимает ориентировочно 4 часа [7, 12].

Заключение

В результате выполнения настоящей работы разработана стратегия индукции АОХ1 промотора при культивировании метилотроф-ных дрожжей Komagataella phaffii , путем поддержания концентрации метанола в диапазоне от 0,6 до 2% на основании концентрации растворенного кислорода в среде.

Разработанная стратегия индукции АОХ1 промотора позволила обеспечить получение не менее 1,87 г./л рекомбинантного белка (фосфолипаза А2) при культивировании Komagataella phaffii на протяжении 96 ч, что в 3,7 раз превосходит результаты, полученные при ведении процесса в соответствии с руководством «Pichia Fermentation Process Guidelines» от Invitrogen.