Разработка технологии получения хитозана из панцирьсодержащего сырья

Здоровье нации стало на сегодняшний день одной из приоритетных государственных задач, над решением которой активно работает индустрия здорового питания. К новым поколениям пищевых продуктов относятся функциональные пищевые продукты, которые снижают риск развития многих заболеваний, связанных с питанием, за счет наличия в их составе физиологически важных веществ, и способствуют сохранению здоровья и долголетия человека.

Один из путей создания функциональных пищевых продуктов — использование в рецептуре традиционных продуктов питания природных биологически активных ингредиентов, выделенных из растительного и животного сырья и продуктов его переработки.

С этой точки зрения перспективен хитозан — деацетилированное производное хитина, определяющего структуру панциря ракообразных, кутикулы насекомых и клеточные стенки грибов. Хитин и хитозан представляют собой смесь олигосахаридов с различной степенью полимеризации.

Хитозан обладает очень широким спектром биологического действия. В качестве биологически активной добавки к пище он способствует снижению уровня холестерина и сахара в крови, нормализует артериальное давление, обладает противоопухолевым и бактериостатическим действием по отношению к патогенным микроорганизмам, улучшает работу кишечника, стимулирует иммунную активность и рост би-фидофлоры. В настоящее время хитозан используется в медицине в качестве ранозаживляющего средства, в косметологии — в очищающих средствах, в пищевой промышленности — как загуститель и структурообразова-тель, в сельском хозяйстве, в технических отраслях — для улучшения качества бумаги, создания нетканых материалов, упаковки для пищевых продуктов и т.д [8].

По своей химической природе хитин является поли-Х-ацетил-В-глюкозо-2-амином, мономерные единицы — N-ацетилглюкозамин, связанные Ь-(1,4)-гликозидными связями.

Рис. 1. Структурная формула хитина и хитозана

Получение хитозана из исходного хитина производится в две стадии: выделение хитина из сырья и его деацетилирование. Хитин в составе растительных и животных оболочек присутствует не в чистом виде, а в виде комплексов: хитин-глюкановый комплекс — в клеточной стенке грибов, хитин-меланиновый — в кутикуле насекомых, хитин-белковый — в панцире ракообразных. Для выделения хитина в чистом виде необходимо разрушить эти комплексы. Наиболее доступен для гидролиза хитин-белковый комплекс панциря ракообразных, к тому же в России в достатке имеется этот вид сырья за счет промысла крабов на Дальнем Востоке, поэтому панцири ракообразных, в частности криля и крабов, являются наиболее доступным видом сырья для получения хитина.

Цель данной работы — получение хитозана из различных панцирьсодержащих отходов (панцирь рака, панцирь креветки, рачок гаммарус) и сравнение его химических свойств. Работа состояла из нескольких этапов.

• 1.    Выделение хитина из различных сырьевых источников.

• 2.    Деацетилирование хитина и получение хитозана.

• 3.    Подтверждение аутентичности полученного хитозана путем сравнения с эталонным продуктом.

• 4.    Изучение физико-химических свойств хитозана из различного сырья.

Выделение хитина.

Выделение хитина из всех видов сырья (панцирь рака, панцирь креветки, рачок гаммарус) проводили по одной методике, включающей в себя стадии депротеинизации и деминерализации [3; 7].

Депротеинизацию проводят раствором гидроксида натрия для удаления белков панциря. Процесс депротеинизации протекает при повышенных температурах 70—90°С и концентрации раствора гидроксида натрия 0,5—1 М в течение 90—150 мин.

Начальное содержание белка может находиться в пределах 25—50% в зависимости от вида сырья, по окончании процесса депротеинизации остаточное количество белка составляет менее 1%. При необходимости получения более чистого хитина процесс депротеинизации может проводиться несколько раз [2].

В своем исследовании мы измельчали сырье до размера частиц 3—5 мм (размер частиц оп ределяли по остатку на сите). Депротеинизацию проводили 1Н раствором гидроксида натрия, соотношение сырья и раствора NaOH — 1:13. Процесс вели при постоянном перемешивании, температуре 80±3°С в течение 120 минут.

В ходе процесса происходило небольшое вспенивание реакционной массы, обусловленное поверхностно-активным свойством белков, наблюдалось первичное обесцвечивание частиц панциря.

Депротеинизированные частицы панциря откидывали на сито и промывали водой, подкисленной соляной кислотой (pH ~ 5), а затем дистиллированной водой до нейтрального значения pH промывных вод.

В процессе деминерализации удаляются соли кальция, фосфаты и карбонаты, обуславливающие прочность покровов (например, панцирь краба), таким образом, цель процесса деминерализации — удаление минеральных солей, таких как карбонат кальция, из депротеинизированного панциря. Деминерализацию проводят растворами соляной кислоты (концентрация 0,5—1,5 М) при температуре не выше 40°С во избежание гидролиза гликозидных связей хитина.

Под действием соляной кислоты нерастворимые в воде соединения кальция переходят в растворимые и могут быть удалены вместе с фильтратом.

Химическое уравнение процесса деминерализации можно представить в следующем виде:

СаСОз + 2НС1 = СаС12 + Н2О + СОД

Начальное содержание минеральных веществ составляет от 15% до 50% в зависимости от вида используемого сырья, по окончании процесса деминерализации остаточное количество минеральных веществ должно быть от 3% до 0,2% [2].

В наших экспериментах мы проводили деминерализацию 1Н раствором соляной кислоты при температуре 22±1°С в течение 120 минут и постоянном перемешивании. В ходе реакции происходило выделение углекислого газа, что приводило к вспениванию реакционной массы. Добавление небольших количеств н-бутанола позволяло избежать сильного пенообразования.

Полученный в результате деминерализации хитин откидывали на сито, промывали водой, подщелоченной NaOH (pH ~ 8) и дистиллированной водой до нейтрального значения pH промывных вод. Полученный хитин был белого цвета и не нуждался в обесцвечивании.

Перед деацетилированием полученный хитин необходимо высушить. Отработку температурного режима сушки мы вели на примере хитина из панциря рака. Высушивание проводили до постоянной массы в вакуум-сушильном шкафу при температуре 30±2°С и при 80±2°С.

В первом случае были получены белые чешуйки хитина в виде хлопьевидного порошка, вторая партия хитина, высушенная при более высокой температуре, имела коричнево-желтый цвет. Опыт показал, что более высокая темпера тура сушки вызывает частичное ороговение и деструкцию хитина с образованием окрашенных продуктов. Такой хитин плохо ацетилируется, полученный из него хитозан обладает меньшей растворимостью. Таким образом, оптимальная температура для сушки хитина 30±2°С. Проведенные исследования позволили определить процентный выход хитина из различных источников сырья. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Процентный выход хитина из различного панцирьсодержащего сырья

Тип сырья	Выход от массы исходного сырья, %
Панцирь рака	16,6
Панцирь креветки	13,6
Рачок гаммарус	5,4

Рис. 2. Деацетилирование хитина

Получение хитозана. Хитозан является самым распространенным производным хитина. Хитозан получают деацетилированием хитина.

Для проведения процесса деацетилирования хитин каждого вида сырья заливали 50%-ным раствором NaOH и нагревали до температуры 120±5°С в течение 90 минут при постоянном перемешивании. Реакционная смесь темнела, что было вызвано разложением остаточного белка в сильно щелочной среде.

Более длительное деацетилирование мы сочли нецелесообразным, так как наиболее ак тивно процесс протекает в первые 90 минут, а дальнейшая обработка щелочью вызывает гидролиз и деструкцию хитозана [3; 4].

По окончании процесса деацетилирования жидкость фильтруют, полученный хитозан промывают водой, подкисленной соляной кислотой до рН~5 и далее дистиллированной водой до получения промывных вод с нейтральным значением pH. Сушка хитозана проводится аналогично сушке хитина.

На основании полученных данных можно рассчитать процентный выход хитозана (табл. 2).

Таблица 2

Процентный выход хитозана из панцирьсодержащего сырья

Вид хитина	Выход хитозана по хитину, %	Выход хитозана по сырью, %
Из панциря рака	79	11,5
Из панциря креветки	78	10,7
Из рачков гаммаруса	62,3	3,37

Как видно из полученных данных, рачки гам-марус в качестве сырьевого источника для получения хитозана менее перспективны, чем раки и креветки. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными источниками [3; 7].

Изучение физико-химических свойств хитозана из разных видов сырья. Важнейшими характеристиками хитозана, определяющими возможность его дальнейшего использования в качестве БАД, полимерной пленки, адсорбента и т.д., являются растворимость, молекулярная масса и степень деацетилирования. Однако сначала мы должны были подтвердить соответствие полученных нами образцов эталонному хитозану, полученному промышленным способом. Для этого мы сравнивали ИК-спектры наших образцов и эталонного образца (метод ИК-спек-троскопии).

ИК-спектроскопия — аналитический метод, широко применяемый в химии для установле ния строения органических соединений. Каждое органическое соединение имеет свой собственный строго индивидуальный спектр, следовательно, ИК-спектроскопия позволяет достоверно определить чистоту и состав вещества. ИК-спектроскопия позволяет проводить как качественный (по характеристическим частотам поглощения), так и количественный (по интенсивности поглощения) анализ [1].

Инфракрасная спектроскопия образцов хитозана. ИК-спектры снимали на ИК-Фурье-спектрометре Perkin Elmer, в диапазоне от 450 до 4000 см"¹. Для определения хитозан прессовали в таблетки с КВг. Результаты обрабатывали в программе IR-Spectrum. Эталонный спектр хитозана брали из библиотеки программы IR-Spectrum. Результаты представлены на рисунке 3 в виде спектрограммы (на примере хитозана из панциря рака).

Рис. 3. Сравнение спектров полученного хитозана и эталонного образца: 1 — ИК-спектр опытного образца; 2 — ИК-спектр эталона

Как видим, различия спектров в полученных образцах хитозана заключаются лишь в интенсивности полос поглощения 3437 см"1 и 1659 см"1. Эти различные интенсивности поглощения полос можно объяснить неодинаковой степенью деацетилирования сравниваемых образцов. Кроме того, используемый для прессования КВг гигроскопичен и при длительном хранении может поглощать какое-то количество воды, в результате чего интенсивность линии поглощения воды в ИК-спектрах увеличивается.

На рисунке 4 представлен ИК-спектр хитозана из панциря рака с указанием основных частот поглощения.

Рис. 4. ИК-спектр полученного образца хитозана

Проводя качественный анализ по ИК-спек-тру образца хитозана, рассмотрим основные характеристические частоты поглощения.

Согласно литературным данным [5], полосы в районе области 3447 и 1655см"1 могут быть интерпретировны как колебания аминогруппы. Следует отметить, что область в районе 3440 см"1 перекрывается с колебаниями свободного гидроксила.

Колебания в районе 1660—1619 см"1 попадают в зону антисимметричных деформационных колебаний NH3+. Колебание в области 893 см"1 является деформационным колебанием Ci-H в Р-сахарах.

Таким образом, анализируя характеристические частоты и сравнивая спектры образцов, можно подтвердить идентичность исследуемых химических соединений.

Для качественного анализа образцов и определения их физико-химических свойств мы проанализировали такие показатели, как раствори мость образцов хитозана в 2% уксусной кислоте, их молекулярная масса, степень деацетилирования.

Растворимость. Определение растворимости хитозана в уксусной кислоте — важный показатель качества. Хитин в отличие от хитозана не растворим в уксусной кислоте, следовательно, проверка растворимости и определение массы нерастворимой фракции хитозана показывает эффективность процесса деацетилирования [1]. Растворимость хитозана в уксусной кислоте обусловлена наличием в хитозане первичных аминогрупп, способных ионизироваться (про-тонироваться) в кислой среде.

Образцы хитозана растворяли в 2% растворе уксусной кислоты при постоянном перемешивании. Через 10 минут раствор фильтровали и определяли массу нерастворенного хитозана по остатку на фильтре после высушивания до постоянной массы. Результаты опыта представлены в табл. 3.

Таблица 3

Содержание нерастворимых фракций в опытных образцах хитозана

Вид хитозана	Доля нерастворимой фракции, %
Из панциря раков	5
Из панциря креветок	4
Из гаммаруса	2

Судя по представленным данным, наименьшее количество нерастворимых частиц содержится в хитозане из гаммаруса.

Определение молекулярной массы хитозана. Молекулярную массу образцов хитозана определяли визкозиметрическим методом. Этот метод является наиболее простым и доступным для определения молекулярной массы полимеров в широкой области значений молекулярных масс [6]. В качестве растворителя использовали 2% раствор уксусной кислоты, измерение вязкости проводили с растворами хитозана концентрацией 0,2; 0,5; 1,0; 1,5%. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Молекулярная масса хитозана

Вид хитозана	Характеристическая вязкость, см’/г	Молекулярная масса, Дальтон
Из панциря раков	3,09	72444
Из панциря креветок	2,68	63200
Из гаммаруса	2,43	57340

Из полученных данных видно, что молекулярные массы образцов отличаются между собой незначительно. Следует отметить, что молекулярная масса получаемого хитозана зависит не только от вида сырья, способа выделения хитина и метода его деацетилирования, но также от условий хранения и срока сбора сырья [1; 7].

Определение степени деацетилирования хитозана. Метод основан на потенциометрическом титровании хлористого водорода, связанного с аминогруппами молекул хитозана [4].

Потенциометрическое титрование растворов хитозана проводили раствором гидроксида натрия (0.1 Н) при помощи ионометра И-160 МП с шагом 0,1 см3. Количество щелочи, необходимое для титрования связанной с аминогруппами кислоты, определяли из графика зависимости электропроводности раствора от объема щелочи. Титрование проводили в трех повторностях, за окончательный результат брали среднее арифметическое значение. Полученные результаты представлены в табл. 5.

Таблица/

Степень деацетилирования образцов хитозана

Вид хитозана	Степень деацетилирования, %
Хитозан из панциря раков	79,5
Хитозан из панциря креветок	88,4
Хитозан из рачков гаммарус	95,0

Степень деацетилирования напрямую связана со способностью хитозана растворяться в кислой среде. Чем выше степень деацетилирования, тем больше свободных аминогрупп, способных к ионизации, следовательно, тем лучше растворимость хитозана. Полученные данные по степени деацетилирования коррелируют с данными по растворимости [6].

Таким образом, в работе был получен хитозан из трех видов сырья со степенью чистоты и физико-химическими характеристиками, позволяющими использовать его не только для технических нужд, но и в качестве биологически активной добавки к пище.