Разработка тест-систем ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium

В настоящее время возбудители микоплазмоза крупного рогатого скота (КРС), вызванного Mycoplasma bovis и M. bovigenitalium , распространены в животноводческих хозяйствах во всем мире, в том числе и в Российской Федерации. Микоплазмозы КРС характеризуются поражением верхних дыхательных путей, серозно-катаральным воспалением легких, артритами, ринитами, пневмониями у молодняка, абортами у беременных животных, вульвовагинитами, маститами и рождением мертвого или нежизнеспособного плода. Экономический ущерб складывается из падежа, вынужденного убоя, недополучения живой массы и потомства, затрат на лечение, профилактику. Разработка методов выявления указанных возбудителей имеет большое значение для контроля микоплазменной инфекции. В настоящем сообщении предлагается тест-система для выявления геномов M . bovis и M . bovigenitalium с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (с подтвержденной эффективностью, специфичностью и высокой аналитической чувствительностью), разработка которой была целью нашего исследования. Мы провели анализ геномных последовательностей M . bovis и M . bovigenitalium из базы данных GenBank (NCBI) и выбрали локус fusA для M . bovis и межгенное пространство генов 16S-23S рРНК для M . bovigenitalium . Определены оптимальные концентрации компонентов реакционной смеси: хлорида магния - 5,5 мМ для M. bovis и 6,0 мМ для M. bovigenitalium , дезоксинуклеозидтрифосфатов - 300 мкМ для M. bovis и 200 мкМ для M. bovigenitalium , праймеров - 0,4 мкМ для M. bovis и 0,3 мкМ для M. bovigenitalium , флуоресцентных зондов - 0,05 мкМ для M. bovis и 0,15 мкМ для M. bovigenitalium , а также подобран следующий температурно-временной режим реакции для M. bovis и M. bovigenitalium : 10 мин при 95 °С (прогрев реакционной смеси), далее 40 циклов ПЦР, состоящих из денатурации ДНК в течение 10 с при 95 °С, отжига праймеров и элонгации кДНК в течение 60 с при 60 °С. Установлены высокая аналитическая специфичность предложенных тест-систем: предел обнаружения ДНК микоплазм составил 25-50 КОЕ/мл при эффективности амплификации 90,94 и 91,85 % соответственно для M . bovis и M . bovigenitalium . При применении разработанных нами методик для тестирования 1342 проб биоматериала от КРС с клиническими признаками репродуктивной и/или респираторной патологии, проанализированных ранее с использованием других методических подходов, показано полное совпадение результатов. Таким образом, на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени нами разработаны специфичные, высокочувствительные и воспроизводимые тест-системы для выявления ДНК M . bovis и M . bovigenitalium при рутинной диагностике микоплазмоза крупного рогатого скота.