Разработка тест-систем ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium

Представители рода Mycoplasma широко распространены во всем мире и способны вызывать у крупного рогатого скота (КРС) мастит, пневмонию, септицемию и нарушения репродуктивной функции (1, 2). Mycoplasma bovis — наиболее распространенный наряду с возбудителем контагиозной плевропневмонии КРС (Mmm SC) и один из этиологических агентов, выявляемых в ассоциации с другими патогенами и вызывающих комплекс респираторных заболеваний КРС (BRDC, bovine respiratory disease complex) с высоким заболеваемостью и смертностью (3, 4). Кроме того, M. bovis — один из основных патогенов, вызывающих множество заболеваний: воспаление дыхательных путей, пневмонию, отит, артриты, кератоконъюнктивиты, эндометрит, маститы, что приводит к значительным экономическим и производственным потерям в мясном и молочном животноводстве, особенно в развивающихся странах (5-7). Mycoplasma bo-vigenitalium связана с репродуктивными нарушениями и маститом у КРС.

Экономический ущерб при поражении данным видом микоплазм связан с бесплодием и снижением репродуктивной способности животных (8-11).

Для выделения микоплазм культуральным методом используют множество жидких, полужидких и плотных питательных сред (12, 13). Однако биологические особенности возбудителей микоплазмоза КРС существенно затрудняют эту процедуру (2).

Недавно было показано, что коммерчески доступные тест-системы для диагностики инфекции, вызванной M . bovis , методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) различаются по характеристикам (14), и хотя подобные подходы могут помочь в идентификации этих инфекций, они не позволяют получить изоляты, которые можно дополнительно охарактеризовать по таким признакам, как, например, устойчивость к противомик-робным препаратам (15).

Для борьбы с микоплазмозом КРС используются антибиотики, но проблема резистентности к противомикробным препаратам вызывает озабоченность и еще больше ограничивает и без того короткий список эффективных лекарственных средств, используемых при заболеваниях, вызванных микоплазмами (16, 17).

На сегодняшний день в доступной литературе представлена информация о различных модификациях полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющих выявлять ДНК M . bovis и M . bovigenitalium в пробах биологического материала (18, 19). Многие исследователи указывали на эффективность идентификации и выявления M . bovis и M . bovigenitalium с использованием ПЦР и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) (20-24). Также для выделения и идентификации M . bovis у КРС использовались бактериологический и молекулярно-генетический методы (25).

В современных условиях оперативность диагностики может быть достигнута за счет применения ПЦР-РВ, что обеспечивает быструю и точную идентификацию генома микоплазм в пробах биологического материла (26). Наличие инструментов молекулярной идентификации геномов M . bovis и M. bovigenitalium позволяет контролировать не только эпизоотическую ситуацию в отечественных хозяйствах, но и проводить контроль как при импорте генетического материала от племенных быков, так и перед его использованием в производственных целях (2, 14, 27).

В нескольких исследованиях, проведенных с использованием ПЦР-РВ, сообщалось об эффективной и достоверной диагностике мастита, вызванного M. bovis . В Индии S. Behera и соавт. (28) применили метод ПЦР-РВ с красителем SYBR green для выявления M. bovis в молоке и легочной ткани, основываясь на идентификации гена uvrC (28). Недавно C.A.M. Becker и соавт. (29), используя ген polC , выявили M. bovis в 51 % положительных проб в 251 носовом мазке от телят на западе Франции. Этот же ген был использован в ПЦР-РВ, которая выявила 58 % образцов с M. bovis в 351 бронхоальвеолярной лаважной жидкости с телячьих ферм в Алжире (30). K. Chauhan и соавт. (31) разработали мультиплексную ПЦР-РВ для одновременного выявления M. bovis , Acholeplasma laidlawii и нескольких видов Mycoplasma — M . californicum , M . bovigenitalium , M. cana-dense , M . arginini и M . alkalescens . Этот набор, разработанный с учетом гена 16S рРНК Mycoplasma , гена rpoB M. bovis и межгенного транскрибируемого спейсера (ITS) 16S-23S рРНК A. laidlawii , позволил обнаруживать и дифференцировать M. bovis от других распространенных видов Mycoplasma spp. и непатогенного A. laidlawii в пробах молока, собранных на молочных фермах Калифорнии в США (31).

В результате исследования 1186 проб биоматериала, полученных из различных регионов Российской Федерации в период с 2015 по 2018 год, геном M. bovis был обнаружен в 10,1 % проб, а геном M. bovigenitalium выявлен в 8,6 % проб (4), кроме того, при исследовании 410 образцов спермы из российских и зарубежных племенных центров ДНК M. bovis обнаружена в 1,2 %, M. bovigenitalium — в 43,4 % образцов (27). Несмотря на то, что имеются данные, свидетельствующие о значительной распространенности M. bovis и M. bovigenitalium среди животных в России, однако комплексная и систематическая лабораторная диагностика микоплазмозов КРС, вызванных этими патогенами, на территории Российской Федерации, к сожалению, не проводится, что осложняет борьбу с заболеванием. Следовательно, необходимы коммерчески доступные российские диагностические тест-систем для выявления ДНК M. bovis и M. bovigenitalium на основе ПЦР-РВ.

В настоящем сообщении мы представили результаты разработки специфичных, высокочувствительных и воспроизводимых тест-систем для выявления ДНК M . bovis и M . bovigenitalium при рутинной диагностике микоплазмоза крупного рогатого скота. Системы валидированы с применением коллекции актуальных штаммов микоплазм КРС и позволяют оперативно и эффективно проводить исследования распространенности указанных микоплазм среди КРС.

Нашей целью была разработка ПЦР-РВ для выявления ДНК наиболее распространенных патогенных микоплазм Mycoplasma bovis и M . bo-vigenitalium .

Ìåòîäèêà . Использовали образцы биологического материала (сыворотка крови, стабилизированная кровь, назальные и трахеальные смывы, фрагменты легких и трахеи, молоко, смывы с препуция, вагинальные смывы, суставная жидкость, абортированные и мертворожденные плоды, а также образцы спермы) от КРС разных возрастных групп. Референсные штаммы бактерий АТСС M. bovis (¹ 25523), M . bovigenitalium (¹ 19852), M . dispar (¹ 27140) получены из коллекции ФГБУ ВНИИЗЖ, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) штамм Madugri-8 получен из коллекции ФГБНУ ФИЦВиМ (Россия). Для оценки специфичности разработанных методик ПЦР-РВ использовали различные бактериальные и вирусные патогены, инфицирующие КРС .

Суммарную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора «Ам-пли Прайм РИБО-сорб» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.

Реакционная смесь для амплификации общим объемом 25 мкл содержала следующие компоненты: 2,5 мкл 10½ ПЦР-Буфер-Б для Taq ДНК-полимеразы (ООО «Синтол», Россия или аналог), 5,5 мкл 25 мМ раствора хлорида магния («Promega», США или аналог) с конечной концентрацией 5,5 мМ для M. bovis и 6,0 мкл 25 мМ раствора хлорида магния («Promega», США или аналог) с конечной концентрацией 6,0 мМ для M. bovigenitalium, 100 мМ водные растворы четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) — дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ «Fermentas», Литва), готовится общая смесь дНТФ и разводится водой, свободной от нуклеаз, до концентрации каждого дНТФ 10 мМ; в реакционную смесь вносили 0,75 мкл 10 мМ дНТФ с конечной концентрацией 300 мкМ для M. bovis и 0,5 мкл 10 мМ дНТФ с конечной концентрацией 200 мкМ для M. bovi-genitalium, 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров и 0,05 мкМ зонда для выявления ДНК Ì. bovis, 0,3 мкМ прямого и обратного праймеров и 0,15 мкМ зонда для выявления ДНК M. bovigenitalium (ООО «Синтол», Россия). Полученный объем реакционной смеси доводили до 20 мкл во- дой, свободной от нуклеаз («Invitrogen», США или аналог). После добавляли в подготовленные пробирки по 20 мкл реакционной смеси и по 5 мкл ДНК исследуемых образцов. Амплификацию проводили в программируемом амплификаторе Rotor-Gene Q («QIAGEN N.V.», Германия).

Для определения аналитической чувствительности системы тестировали 10-кратные последовательные разведения ДНК, выделенной из чистой культуры M . bovis (2,5½10⁶ КОЕ/мл) и M . bovigenitalium (5,0½10⁵ КОЕ/мл). Титры микоплазм определяли методом серийных разведений с посевом на плотные питательные среды и выражали в КОЕ/мл (32, 33).

Эффективность амплификации оценивали, используя последовательные 10-кратные разведения положительного образца биоматериала, содержащего ДНК микоплазм, в трех повторностях. Эффективность амплификации вычисляли согласно формуле Е = (101/slope - 1) ½ 100 %, где slope — наклон линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации кДНК-матрицы.

Статистическую обработку данных проводили по 10 результатам измерений, вычисляли средние ( Ì ), их стандартные отклонения (±SD), выполняли регрессионный анализ, для оценки воспроизводимости и сходимости (повторяемости) рассчитывали коэффициент вариации ( Cv , %, не должен превышать 10 %). Для оценки промежуточной прецизионности в условиях повторяемости (сходимости) использовали один образец, который тестировали в 5 повторностях в трех повторных постановках ПЦР-РФ ( n = 15).

Ðåçóëüòàòû. На первом этапе мы разрабатывали подходы для идентификации ДНК микоплазм, для чего c помощью алгоритма множественного выравнивания последовательностей MAFFT были проанализированы генетические последовательности из базы данных GenBank NCBI . В результате для M. bovis в качестве целевого был выбран ген fusA (93 п.н.), кодирующий фактор элонгации G, который необходим при трансляции мРНК, а для M. bovige-nitalium — межгенная спейсерная область для 16S-23S рРНК (127 п.н.).

Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР-РВ при выявлении ДНК M . bovis и M . bovigenitalium были подобраны оптимальные концентрации следующих компонентов: хлорида магния, дНТФ, праймеров, флуоресцентного зонда, а также температурно-временной режим реакции, при которых наблюдалась наивысшая интенсивность ответного флуоресцентного сигнала при высокой специфичности.

Ионы магния важны для функционирования ДНК-полимеразы, к тому же они оказывают значительное влияние на специфичность гибридизации праймеров, в то время как дНТФ представляют собой важнейшие структурные единицы молекул нуклеиновых кислот (34). Для оптимизации концентраций растворов хлорида магния и дНТФ комбинировали разные объемы 25 мM хлорида магния (от 2 до 6 мкл с шагом 0,5 мкл) с разными объемами 10 мМ дНТФ (от 0,25 до 2 мкл с шагом 0,25 мкл). Мы установили, что оптимальным при проведении ПЦР-РВ было добавление к смеси 5,5 мМ и 6,0 мМ раствора MgCl 2 , 300 мкМ и 200 мкМ раствора дНТФ соответственно для M. bovis и M. bovigenitalium . Такое сочетание этих реагентов использовали на следующих этапах подбора концентраций компонентов в реакционной смеси.

Оптимальные концентрации праймеров и зонда для M . bovis и M . bo-vigenitalium определяли эмпирически. Для этого подбирали композицию из прямого и обратного праймеров (10 пмоль/мкл) различных объемов (от 0,5 до 1,5 мкл с шагом 0,25 мкл) и TaqMan-зонда (2,5 пмоль/мкл) в объеме от

0,5 до 2 мкл с шагом 0,5 мкл. В результате наименьшие значения Ct и изменение максимальных значений флуоресценции положительных проб на графике реакции были зафиксированы при добавлении к смеси 0,4 мкМ и 0,3 мкМ каждого из праймеров, 0,05 мкМ и 0,15 мкМ зонда соответственно для M . bovis и M . bovigenitalium .

1. Значения порогового цикла Сt для Mycoplasma bovis и M. bovigenitalium при оптимизации температуры отжига ПЦР-РВ

Стадия реакции	Температура	Время	Число циклов	Среднее значение Ct
				M. bovis	M. bovigenitalium
	1-й	режим
Прогрев реакционной смеси	95 ° С	10 мин	1
Денатурация	95 ° С	10 с	40	29,62	34,26
Отжиг праймеров и элонгация	60 ° С	60 с
	2-й	режим
Прогрев реакционной смеси	95 ° С	5 мин	1
Денатурация	95 ° С	10 с		41 1 4
Отжиг праймеров	60 ° С	20 с	40
Элонгация	72 ° С	20 с
	3-й	режим
Прогрев реакционной смеси	95 ° С	5 мин	1
Денатурация	95 ° С	10 с		31 49	39 13
Отжиг праймеров	58 ° С	20 с	45
Элонгация	72 ° С	20 с

Оптимизация температурно-временного режима ПЦР-РВ проводилась с ранее оптимизированными концентрациями хлорида магния для получения средних значений Сt. Результаты подбора температуры отжига представлены в таблице 1.

На основании выбранного в опытах сочетания времени и температуры в оптимизированном варианте для постановки ПЦР-РВ для M . bovis и M. bovigenitalium использовали следующий режим: 10 мин при 95 °С (прогрев реакционной смеси), далее 40 циклов ПЦР, состоящих из денатурации ДНК в течение 10 с при 95 °С, отжига праймеров и элонгации кДНК в течение 60 с при 60 °С.

Для определения специфичности методик, разработанных для идентификации двух видов микоплазм, в выбранном нами режиме и с теми же праймерами и зондом были протестированы образцы с референсными штаммами M. bovis и M. bovigenitalium и гетерологичными бактериями и вирусами, инфицирующими КРС. Проведенные испытания продемонстрировали, что разработанные ПЦР-РВ не дают ложноположительных или ложноотрицательных результатов, что свидетельствует об их специфичности (табл. 2).

2. Определение специфичности праймеров для выявления геномов Mycoplasma bovis и M. bovigenitalium в ПЦР-РВ ( n = 3)

Объект	Штамм/изолят	Результаты ПЦР-РВ
		M. bovis M. bovigenitalium

Изоляты

Mycoplasma bovis	Калуга 2020	пол.	отр.
Mycoplasma bovis	полевой изолят	пол.	отр.
Mycoplasma bovigenitalium	полевой изолят	отр.	пол.
Mycoplasma gallisepticum	S6	отр.	отр.
Mycoplasma synoviae	WVU 1853	отр.	отр.
	Штаммы
Mycoplasma bovis	АТСС 25523	пол.	отр.
Mycoplasma bovigenitalium	АТСС 19852	отр.	пол.
Mycoplasma dispar	АТСС 27140	отр.	отр.
Escherichia coli	ЕС-21	отр.	отр.
Pasteurella multocida	¹ 1414	отр.	отр.
Mannheimia haemolytica	¹ 1412	отр.	отр.
Bovine respiratory syncytial virus (BRSV)	Вологда/2020	отр.	отр.

Ïðîäîëæåíèå òàáëèöû 2

Bovine alphaherpes virus (BoHV-1)	ВНИИЗЖ	отр.	отр
Bovine parainfluenza 3 virus (BPIV3)	ВГНКИ-4	отр.	отр
Bovine viral diarrhea virus (BVDV)	NADL	отр.	отр
Mycoplasma mycoides subsp . mycoides SC (MmmSC) Madugri-8		отр.	отр

Примечание. отр. — геном M. bovis/M. bovigenitalium не выявлен; пол. — геном M. bovis/M. bovi-genitalium выявлен.

Эффективность амплификации оценивали в 3-кратной повторности с помощью серии последовательных 10-кратных разведений ДНК M. bovis и M. bovigenitalium , выделенных из бактериальной суспензии. На основе полученных средних величин пороговых циклов каждого разведения значение эффективности амплификации (Е) составило 90,94 % для M. bovis и 91,85 % для M. bovigenitalium .

Рис. 1. График линейной зависимости результатов ПЦР-РВ при тестировании 10-кратных разведений ДНК Mycoplasma bovis (слева) и M. bovigenitalium (справа) ( n = 3, M ±SD).

Повторяемость (сходимость) результатов разработанных ПЦР-РВ оценивали по стандартному отклонению (±SD) значения Сt для каждого из разведений, которое для M. bovis варьировало от 0,21 до 0,58, для M. bovigenitalium — от 0,07 до 0,10. Коэффициент детерминации (R²) при этом составил 0,9985 для M . bovis и 0,9997 для M . bovigenitalium (рис. 1).

Воспроизводимость методик оценивали при исследовании ДНК M . bovis и M . bovigenitalium (одного положительного образца, который тестировали в 5 повторностях в трех постановках ПЦР-РВ) (табл. 3).

3. Вариабельность значений Ct в ПЦР-РВ для Mycoplasma bovis и M. bovigeni-talium ( n = 15)
Патоген	Тест-система	Ì Сt	±SD	Cv , %
M. bovis	Запуск 1-й	31,01	0,47	1,51
	Запуск 2-й	31,66	0,31	0,98
	Запуск 3-й	31,77	0,28	0,88
	Суммарно ( n = 15)	31,48	0,48	1,52
M. bovigenitalium	Запуск 1-й	29,70	0,13	0,44
	Запуск 2-й	29,75	0,04	0,14
	Запуск 3-й	28,28	0,07	0,25
	Суммарно ( n = 15)	29,08	0,08	0,28

Можно отметить, что среднее значение порогового цикла (Ct) на протяжении трех повторных постановок ПЦР-РВ варьировало для M. bovis от 31,01 до 31,77 с разбросом стандартного отклонения (±SD) от 0,28 до 0,47 и для M. bovigenitalium от 28,28 до 29,75 с разбросом SD от 0,04 до 0,13. В среднем коэффициент вариации (Cv) составил 1,52 и 0,28 % соответственно для M. bovis и M. bovigenitalium, то есть полученные значения соответствуют требованиям (менее 10 %). Суммирование результатов трех повторных постановок ПЦР-РВ показало еще меньшую вариабельность: для M. bovis и M. bovigenitalium средние значения порогового цикла равны соответственно 31,48 и 29,08 при абсолютных значениях SD 0,48 и 0,08.

Рис. 2. Аналитическая чувствительность (LOD) ПЦР-РВ для выявления Mycoplasma bovis и M. bovi-genitalium ( n = 3, 25 и 50 КОЕ/мл).

Аналитическую чувствительность разработанных методик (предел обнаружения ДНК M . bovis и M . bovigenitalium ) определяли с ДНК, выделенной из нескольких последовательных 10-кратных разведений бактериальных суспензий с исходными концентрациями 2,5½10⁶ и 5½10⁵ КОЕ/мл соответственно для M . bovis и M. bovigenitalium . Каждое разведение исследовалось при трех повторных постановках ПЦР-РВ (рис. 2, табл. 4). Установлено, что для разработанных тест-систем на основе ПЦР-РВ предел обнаружения ДНК M . bovis составил 25 КОЕ/мл, M . bovigenitalium — 50 КОЕ/мл.

4. Аналитическая чувствительность ПЦР-РВ для выявления Mycoplasma bovis и M. bovigenitalium ( n = 3)

Разведение геномной ДНК	M. bovis		M. bovigenitalium
	Характеристика матрицы	Сt ( Ì ±SD)	Характеристика матрицы	Сt ( Ì ±SD)
10	2 500 000 КОЕ/мл	17,56±0,19	500 000 КОЕ/мл	14,55±0,00
10 - 1	250 000 КОЕ/мл	20,68±0,10	50 000 КОЕ/мл	18,43±0,08
10 - 2	25 000 КОЕ/мл	24,09±0,22	5000 КОЕ/мл	22,59±0,12
10 - 3	2500 КОЕ/мл	27,33±0,34	500 КОЕ/мл	27,71±0,19
10 - 4	250 КОЕ/мл	30,96±0,25	50 КОЕ/мл	32,74±0,54
10 - 5	25 КОЕ/мл	35,00±0,83	5 КОЕ/мл	–
10 - 6	2,5 КОЕ/мл	–	–	–

Примечание. «–» — отрицательный результат реакции.

Исходя на наблюдаемых значениях Ct и стандартных кривых, можно утверждать, что разработанные нами методы продемонстрировали высокую чувствительность и специфичность, а эффективность амплификации (E) составила 90,94 % для M. bovis и 91,85 % для M. bovigenitalium . По данным А.Д. Козловой с соавт. (27), эти значения составили 99 и 87 % соответственно для M . bovis и M . bovigenitalium , а K. Chauhan с соавт. (31) сообщили, что для M. bovis и M. bovigenitalium эффективность амплификации в ПЦР-РВ составила соответственно 88,8 и 100,9 % в синглплексе и 96,8 и 97,9 % в мультиплексе.

В предыдущих исследованиях разные гены M. bovis, включая uvrC (26, 28, 35, 36, 39), gltX (40), fusA (38) и oppD (37), выбирались в качестве мишеней для выявления этого вида с помощью различных вариантов ПЦР. Было показано, что некоторые из этих мишеней не обладают специфичностью для M. bovis (41-44), а многие не прошли достаточной валидации с использованием полевых проб, полученных из дыхательных путей КРС (36, 38, 43). В нашем исследовании разработаны новые методы ПЦР в режиме реального времени на основе гена fusA M. bovis и гена 16S-23S рРНК M. bovigenitalium, и установлено, что эти методы ПЦР-РВ являются более быстрыми, чувствительными, специфичными и менее трудоемкими, чем классическая ПЦР.

В дополнение к этому, в нашей работе провели валидацию праймеров и зондов согласно MIQE (45), рассчитав такие критические валида-ционные параметры ПЦР-РВ, как эффективность амплификации на основе линейной регрессии и коэффициента наклона, воспроизводимость, повторяемость, вариабельность значений Ct при разных постановка ПЦР-РВ.

С помощью разработанных тест-систем мы исследовали 1342 пробы биоматериала от КРС с клиническими признаками репродуктивной и/или респираторной патологии, поступившие в ФГБУ ВНИИЗЖ из 32 субъектов Российской Федерации в период с 2020 по 2022 год. В результате частота выявления ДНК Ì . bovis составила 10,37 %, M . bovigenitalium — 11,08 %, что согласуется с ранее опубликованными нами данными (4).

Итак, для выявления ДНК Mycoplasma bovis и M . bovigenitalium методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) мы разработали и валидировали тест-системы с высокой аналитической чувствительностью (100 %) и специфичностью (100 %). Предел обнаружения ДНК M. bovis и M. bovige-nitalium составил соответственно 25 и 50 КОЕ/мл, эффективность амплификации в ПЦР-РВ — соответственно 90,94 и 91,85 %. С помощью разработанных тест-систем на основе ПЦР-РВ ДНК M. bovis и M. bovigenitalium успешно выявлена в пробах биологического материала. Предложенные тест-системы могут применяться при скрининговых исследованиях на наличие инфекций, вызванных M. bovis и M. bovigenitalium .