Ветеринарная микробиология. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Статья научная
Инфекционный ринит кур (гемофилез кур) - заболевание, зарегистрированное во многих странах мира. В Российской Федерации отсутствует информация о степени его распространения в птицеводческих хозяйствах, равно как и о серотиповом разнообразии возбудителя, циркулирующего в стране. В настоящей работе впервые приведены биохимические характеристики и определено антигенное родство новых изолятов Avibacterim paragallinarum , полученных от кур с респираторной патологией из ряда хозяйств, а также представлены результаты создания подраздела базы данных масс-спектров исследуемых микроорганизмов, используемых в качестве референтных при идентификации и белковом профилировании штаммов и изолятов возбудителя инфекционного ринита кур. Цель работы - определение биохимических и антигенных свойств изолятов Avibacterium paragallinarum , выявленных в Российской Федерации и Республике Беларусь, и получение специфичных для представителей вида масс-спектров с их последующим анализом и использованием для идентификации и внутривидовой дифференциации. Референтный штамм A. pa-ragallinarum № 29545 АТСС (серотип А1) был получен из коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГБУ ВНИИЗЖ). В исследовании использовали 13 изолятов бактерий A. paragallinarum , выделенных из патологического материала (содержимого подглазничных синусов и конъюнктивального мешка, экссудата из носовой полости, ткани легкого) от кур с респираторной патологией при обследовании птицеводческих хозяйств в 2015 году. Изоляты высевали на агар Columbia, содержащий 5 % дефибринированной крови барана, с посевом штамма Staphylococcus epidermidis в качестве баккормилки. Чистые культуры возбудителя выращивали на сывороточном агаре, содержащем 20 мкг/см3 НАДФ и 5 % сыворотки крови лошади. Бактерии культивировали 24-72 ч при 37 °С в условиях повышенного содержания углекислого газа. Двустороннее антигенное родство референтного штамма АТСС № 29545 и изолятов A. paragallinarum определяли в реакции агглютинации на стекле. Гемагглютинирующую активность оценивали в реакции торможения гемагглютинации. Гомогенность серогруппы исследуемых изолятов подтверждали методом ПЦР. Присутствие амплифицированных фрагментов ДНК размером 800 п.н. указывало на наличие генома A. paragallinarum серогруппы А, 1000-1100 п.н. - серогруппы В, 1500-1600 п.н. - серогруппы С. Идентификацию бактерий A. paragallinarum осуществляли на масс-спектрометре MALDI Autoflex III Biotyper («Bruker Daltonik GmbH», Германия). Запись, обработку и анализ полученных масс-спектров проводили в программе FlexControl 3.4 («Bruker Daltonik GmbH», Германия) в соответствии с MALDIBiotyper 2.0. UserManual, Version 2.0 SR1 (Germany, 2008). При определении биохимических свойств было установлено, что изоляты A. paragallinarum представляют собой неоднородную группу. Зависимость роста изолятов A. paragallinarum от присутствия в питательной среде сыворотки крови была абсолютной. Сахаролитическая активность изолятов различалась. Все изоляты и референтный штамм ферментировали сахарозу и глюкозу, но не трегалозу, лактозу и галактозу. Вариабельность признака наблюдали в отношении маннита и маннозы. По антигенным свойствам все исследуемые изоляты принадлежали к одной серогруппе В, что также подтвердили методом ПЦР в реальном времени. При изучении протеомических свойств штаммов изолятов A. paragallinarum были определены характерные пики m/z 4768-4770 и 5347-5349 масс-спектров, аналогичные таковым для референтного штамма A. paragallinarum ATCC № 29545. Масс-спектры белковых профилей изучаемых изолятов и штаммов включены в базу данных масс-спектрометра MALDI Autoflex III Biotyper, что позволило повысить степень достоверности видовой идентификации A. paragallinarum . На основании изученных биохимических, антигенных и протеомных характеристик три изолята депонированы в Государственную коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ Федеральный центр охраны здоровья животных как A. paragallinarum штамм № 1818, A. paragallinarum штамм № 5111 и A. paragallinarum штамм № 1116.
Бесплатно
Статья научная
Ограничение распространения и циркуляции антибиотикоустойчивых возбудителей бактериальных инфекций требует проведения санитарно-противоэпидемических, противоэпизоотических мероприятий, в том числе на предприятиях промышленного птицеводства. В настоящей работе впервые в сравнительном аспекте представлены данные многолетнего мониторинга распространенности и антибиотикоустойчивости энтеробактерий с комплексной оценкой эффективности основных ветеринарных препаратов, содержащих фторхинолоны и колистин. Нашей целью было изучение видового разнообразия и сравнительная оценка антибиотикоустойчивости штаммов энтеробактерий, выделенных от цыплят-бройлеров ( Gallus gallus ) в крупном птицеводческом комплексе (АО «ПРОДО Птицефабрика Пермская», Пермский край). Исследовали патологический материал от птицы после вынужденного убоя (трахея, легкие, сердце, печень, селезенка, костная ткань - бедренная и большеберцовая кости) и эмбрионов-задохликов (в 2004-2009 годах 995 проб, в 2010-2017 годах 991 проба)...
Бесплатно
Статья научная
Микроорганизм Histophilus somni (сем. Pasteurellaceae ) часто встречается у крупного рогатого скота (КРС), осложняет течение респираторных вирусных заболеваний и может вызывать мультисистемное заболевание, известное как гистофилез. Для лечения заболеваний, вызванных микроорганизмами семейства Pasteurellaceae , наиболее часто применяются аминогликозиды, сульфаниламиды, бета-лактамы, тетрациклины и макролиды, в связи с чем можно ожидать формирование устойчивости H. somni к препаратам этих групп. В настоящей работе впервые охарактеризована устойчивость к антимикробным препаратам изолятов H. somni , выделенных от КРС на территории Российской Федерации. Впервые установлена циркуляция резистентных штаммов H. somni в российских животноводческих хозяйствах. Нашей целью было изучение антибиотикорезистентности циркулирующих штаммов Histophilus somni с помощью фенотипических и генотипических методов и оценка возможности использования ПЦР для прогнозирования устойчивости H. somni к антимикробным средствам нескольких групп. Молекулярно-генетическое определение антибиотикорезистентности проводилось на основе идентификации генов blaOXA-2, sul2, strA, strB, aadA25, aphA1, tetH. В работе использовали культуры H. somni , выделенные в 2018-2019 годах из биологического материала (паренхиматозные органы, смывы, сперма) крупного рогатого скота разных пород, возрастных, половых и физиологических групп (всего 145 животных). Чувствительность изолятов H. somni к 13 антибактериальным препаратам, относящимся к 4 классам (аминогликозидам, бета-лактамам, тетрациклинам и сульфаниламидам), тестировали диско-диффузионным методом. ДНК выделяли из культур H. somni и использовали для выявления генетических детерминант устойчивости к антибиотикам. Изоляты H. somni были протестированы на наличие семи генов устойчивости к антибиотикам ( tetH , blaOXA-2 , aadA25 , strA , strB , aphA1 , sul2 ) методом ПЦР с электрофоретической детекцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Всего были выделены и идентифицированы 18 изолятов H . somni , при этом вырастить в достаточном количестве и оценить на чувствительность к антибиотикам удалось лишь 12 образцов. Наибольшую фенотипическую устойчивость выявили к аминогликозидам: резистентность к стрептомицину составляла 50 %, а устойчивость к неомицину превышала 40 %. У устойчивых образцов были обнаружены гены резистентности aadA25 , strA , strB и aphA1 . Резистентность к сульфаниламидам также оказалась велика и была выявлена у 33 % образцов, в каждом из которых методом ПЦР идентифицировали ген устойчивости sul2 . По результатам микробиологического исследования чувствительность к пенициллинам составила 75 %, к цефалоспоринам приближалась к 100 %. Чувствительность к препаратам группы тетрациклинов оказалась выше 80 %. При этом гены устойчивости к тетрациклинам ( tetH ) и пенициллинам ( blaOXA-2 ) обнаружены не были. По-видимому, устойчивость образцов была обусловлена другими механизмами резистентности. Мультирезистентными оказались два изолята H. somni : они проявляли устойчивость к препаратам классов аминогликозидов, бета-лактамов и тетрациклинов. Четыре образца показали устойчивость к препаратам сразу двух различных групп антибиотиков: два образца - к аминогликозидам и сульфаниламидам (в них были идентифицированы гены strA , strB , aadA25 , aphA1 и sul2 ), два образца - к аминогликозидам и бета-лактамам (у них обнаружили только гены устойчивости к аминогликозидам aadA25 и strA ). За исключением образцов, устойчивых к тетрациклинам и пенициллинам, в которых не были выявлены ожидаемые генетические детерминанты резистентности, все наблюдаемые фенотипы устойчивости к противомикробным препаратам соответствовали результатам ПЦР-исследования. Сочетание генотипического и фенотипического методов определения антибиотикорезистентности способствует лучшему пониманию механизмов устойчивости бактерий к антимикробным препаратам, а также позволяет повысить эффективность мониторинга антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделяемых от продуктивных животных.
Бесплатно
Статья научная
Генетические детерминанты штаммов бактерий Bacillus sp., определяющие возможность биосинтеза разнообразных антимикробных соединений, представляют особый научный интерес, поскольку благодаря им эти микроорганизмы нашли широкое применение в качестве основы пробиотиков. Важный этап системного анализа механизмов пробиотического действия, в частности антимикробной активности микроорганизмов, - реконструкция его метаболической карты, то есть сбор и визуализация всех потенциально возможных процессов в клетке. В представленной работе впервые описаны потенциально заложенные генетические механизмы синтеза ряда биологически активных веществ у выделенного нами ранее штамма бактерии Bacillus megaterium В-4801, в частности возможность синтезировать каносамин - бактериоцин, относящийся к группе аминогликозидов, который может выполнять важную роль в реализации пробиотических свойств благодаря выраженной антимикробной активности. Нашей целью было изучение антимикробной активности штамма Bacillus megaterium В-4801 в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, а также поиск генов, связанных с антимикробной активностью, на основе полногеномного секвенирования. Штамм B. megaterium В-4801, депонированный в коллекции ООО «БИОТРОФ+», обладает выраженной пробиотической активностью. Антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus , Candida tropicalis , Clostridium sp., Escherichia coli оценивали методом отсроченного антагонизма (метод «колодцев»). Библиотеку ДНК для полногеномного секвенирования готовили с помощью набора Nextera XT («Illumina, Inc.», США). Нуклеотидные последовательности определяли с использованием прибора MiSeq («Illumina, Inc.», США) и комплекта реактивов MiSeq Reagent Kit v3 (300-cycle) («Illumina, Inc.», США). Недостоверные последовательности и адаптеры удаляли с помощью программы Trimmomatic-0.38. Отфильтрованные по длине не менее от 50 до 150 п.н. парноконцевые последовательности собирали de novo с использованием геномного сборщика SPAdes-3.11.1. Функциональную аннотацию генома проводили в программах PROKKA 1.12 и RAST 2.0. Оценку пула генов, связанных с антимикробной активностью, и построение метаболической карты выполняли с помощью базы данных KEGG Pathway (http://www.genome.jp/kegg/). Культуральными методами была выявлена антагонистическая активность B. megaterium В-4801 в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Зоны задержки роста тест-штаммов составляли от 2±0,15 до 25±1,4 мм. Геном штамма B. megaterium В-4801 был представлен одной кольцевой хромосомой размером 6 113 972 п.н., содержащей 37,5 % ГЦ-пар. Показано, что более 45 % генов B. megaterium В-4801 вовлечены в функции транспорта и метаболизма аминокислот, транскрипции, трансляции, транспорта и метаболизма углеводов, белков. Определены ключевые генетические локусы, детерминирующие синтез антимикробных метаболитов. В составе генома секвенированного штамма локализованы гены ( FabD , FabF , FabG , FabZ , FabI и др.), связанные с продукцией белков, участвующих в синтезе алифатических ненасыщенных карбоновых кислот с числом углеродных атомов от 3 до 18, в частности масляной, капроновой, каприловой, каприновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, стеариновой, олеиновой. Согласно имеющимся сведениям, все эти вещества обладают выраженными антимикробными свойствами. Кроме того, нами обнаружен целый кластер генов ( Asm22-24 , Asm43-45 , Asm47 ), связанных с биосинтезом бактериоцина каносамина, который относится к группе аминогликозидов, а также поликетидных ансамициновых антибиотиков из группы макролидов. Установленный пробиотический потенциал свидетельствует о роли исследованного штамма как потенциального кандидата в качестве основы для пробиотиков, в том числе для использования в животноводстве. Проведенный геномный анализ выявил новые системы оперонов, контролирующих метаболические пути синтеза антимикробных веществ, ранее не описанные для B. megaterium .
Бесплатно
Микробиота рубца у северных оленей (Rangifer tarandus) с клиническими проявлениями некробактериозов
Статья научная
Некробактериоз - инфекционное заболевание, поражающее многие виды домашних и диких млекопитающих, птиц, человека. Основные клинические проявления болезни связывают с развитием гнойно-некротических поражений кожи, слизистых, внутренних органов, конечностей в результате инфицирования строго анаэробными патогенными фузобактериями - Fusobacterium necrophorum. Для оленеводства некробактериоз северных оленей ( Rangifer tarandus ) относится к одной из наиболее серьезных проблем, поскольку он становится причиной существенных потерь в экономической и хозяйственной деятельности населения в районах Крайнего Севера. В представленном исследовании нами впервые проанализированы различия между составом микробиоты рубца у клинически здоровых северных оленей и животных с проявлениями некробактериоза. Целью исследования была характеристика микробиоты рубца северного оленя при некробактериозе с использованием молекулярных методов. Объектом исследования были северные олени ненецкой породы (здоровые и с признаками некробактериоза), в том числе телята (4-6 мес) и взрослые животные (3-6 лет)...
Бесплатно
Свойства экспериментальных образцов вакцины против инфекционного ринита кур
Статья научная
Инфекционный ринит кур (возбудитель Avibacterium paragallinarum ) встречается во всех странах мира с развитым птицеводством, в том числе в Российской Федерации, и наносит серьезный экономический ущерб. Основным звеном в системе мер борьбы с инфекционным ринитом кур служит специфическая профилактика. Вакцинация птиц обеспечивает выработку напряженного иммунитета, обусловленного наличием антигемагглютинирующих антител. В настоящей работе впервые представлены результаты, характеризующие безвредность, антигенные и протективные свойства образцов вакцины, включающей антиген нового отечественного штамма A. paragallinarum № 5111 серогруппы В. Цель работы состояла в оценке безвредности, антигенных и протективных свойств образцов сорбированной и эмульсионной вакцины против инфекционного ринита кур на основе антигена штамма Avibacterium paragallinarum № 5111. Для изготовления экспериментальных образцов вакцины использовали цельноклеточный антиген штамма A. paragallinarum № 5111 (серотип В-1), инактивированный формальдегидом. Концентрация бактерий в объеме прививной дозы (0,5 см3) каждого образца составляла 109 микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Образец сорбированной вакцины содержал 3,75 мг гидроокиси алюминия в иммунизирующей дозе. Образец эмульсионной вакцины содержал в составе масляный адъювант Montanide ISA 70 VG («SEPPIC», Франция) в количестве 70 % по массе. Иммунобиологические свойства вакцины оценивали в 2019 году на 125 серонегативных к A. paragallinarum цыплятах ( Gallus gallus L.) кросса Хайсекс коричневый в возрасте 1,5-2,0 мес. Безвредность образцов вакцины определяли при инъекциях цыплятам в 2-кратной дозе (1,0 см3). Каждый образец вводили подкожно в область средней трети шеи и внутримышечно в область груди (по 5 гол. в каждом варианте). Наблюдение за клиническим состоянием птиц и наружный осмотр осуществляли в течении 42 сут. По завершении эксперимента проводили убой птицы и визуальную оценку состояния тканей в месте инъекции на разрезе. Протективные свойства вакцины определяли на 75 цыплятах (три группы по 25 гол. в каждой). Птицу I группы иммунизировали образцом сорбированной вакцины, II группы - эмульсионным образцом, III группу не вакцинированных цыплят использовали в качестве контроля. Образцы вводили подкожно в среднюю треть шеи в дозе 0,5 см3, 2-кратно с интервалом 20 сут. Спустя 15 сут после ревакцинации цыплят заражали 1-суточной бульонной культурой штамма A. paragallinarum № 5111 с концентрацией 5 ед. по оптическому стандарту мутности. В течение 7 сут после заражения наблюдали за клиническим состоянием цыплят. Во время эксперимента и по завершении опыта проводили патологоанатомическое вскрытие с бактериологическим анализом содержимого носовых пазух. Антигенные свойства вакцины и продолжительность иммунитета определяли на 30 птицах (три группы по 10 гол. в каждой). Цыплят I группы иммунизировали сорбированной вакциной, II группы - эмульсионной вакциной, контролем служила III группа не вакцинированных птиц. Антигенную активность образцов оценивали по содержанию гуморальных антител в реакции торможения гемагглютинации. При введении вакцины наблюдали поражения тканей легкой и средней степени тяжести без выраженной воспалительной реакции. В месте подкожного введения образца сорбированной вакцины у отдельных цыплят возникала незначительная отечность и гиперемия подкожной клетчатки, а в месте инъекции эмульсионного образца у всех птиц происходило образование соединительнотканных гранулем с наличием остатков вакцины без некротических поражений и выраженной воспалительной реакции окружающих тканей. При сравнении результатов контрольного заражения птиц, иммунизированных разными образцами вакцины, значимых различий не наблюдали (р > 0,05), однако отмечали существенную разницу между опытными и контрольной группами (р 0,05). Их существенное увеличение наблюдали спустя 15 сут после повторного введения обоих образцов вакцины, а через 60 сут содержание антител достигало максимальных значений. У птиц из I группы средний титр антител составил 7,5±0,8 log2, из II группы - 8,9±0,7 log2 (р > 0,05). Через 240 сут после ревакцинации в I группе наблюдали снижение количества антител до 5,5±0,7 log2, во II группе средний титр составлял 8,7±0,8 log2 (р > 0,05). У птиц контрольной группы в течение всего срока наблюдения специфические антитела к возбудителю инфекционного ринита не выявляли. Таким образом, опытные образцы сорбированной и эмульсионной вакцины против инфекционного ринита были безвредными для птиц при подкожном введении и обладали высокой антигенной и протективной активностью после двукратного применения.
Бесплатно
