Разработка жидкой питательной среды для культивирования пробиотического штамма бактерии Bacillus subtilis ТНП-3

В настоящее время во многих странах мира и в том числе России, для получения безопасной животноводческой продукции идет активный поиск, разработка и производство пробиотических добавок, как альтернативы кормовым антибиотикам. Их применение наиболее эффективно в промышленном животноводстве, птицеводстве, рыболовстве, для переваримости и усвояемости кормов, повышения темпов роста и производительности. При этом использование пробиотических кормовых добавок нормализует микробиоту кишечника, способствует повышению иммунобиологической реактивности организма, тем самым профилактирует от заболеваний животных, способствует сохранности поголовья и исключения применения кормовых антибиотиков [6, 13].

В условиях Крайнего Севера одним из главных отраслей северного животноводства является скотоводство, перед которой стоит задача увеличения поголовья путем получения и сохранения молодняка. Учеными Якутской НИИСХ создан пробиотик «Сахабактисубтил», который применяют для профилактики и лечения заболеваний желудочнокишечного тракта новорожденных телят и поросят [8]. Пробиотик «Сахабактисубтил» разработан на основе двух штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5, которые выделены из мерзлотных почв. Они обладают широким спектром уникальных биологических свойств: выраженным антагонистическим действием в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (бактерии, грибы и вирусы), интерферониндуцирующей активностью, иммуностимулирующим эффектом, антибиотикоустойчивостью, способностью стимулировать рост и развитие полезной микрофлоры кишечника, в частности бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium [12]. Арктические штаммы бактерий рода Bacillus являются одними из наиболее перспективных микроорганизмов для разработки агробиотехнологических препаратов [14].

Способность спорообразующих бактерий оказывать пробиотическое действие привела к разработке на их основе препаратов, отнесенных к поколению так называемых биоэнтеросептиков – «самоэлиминирующихся антагонистов» (бактерии, которые не являются специфичными обитателями желудочно- кишечного тракта и которые, как правило, быстро выводятся из организма) [1]. Российскими учеными на основе представителей рода Bacillus для кормления сельскохозяйственных животных разработано более двадцати пяти пробиотических добавок. К ним относятся: «Ветом», «Ветоспорин-Ж», «Карбитокс», «Субтиспорин», «Энзимспорин», «СИМБОС-про», «Ветастар» и другие. Эти кормовые добавки состоят из сочетаний живых штаммов рода Bacillus, подвергнутых либо лиофильному высушиванию и представляющие собой порошкообразную или гранулированную форму, либо жидкую, являющуюся накопительной средой с микроорганизмами. Пробиотические добавки обладают антагонистической активностью против патогенных и условно-патогенных бактерий, антибиотикоустойчивы. Их применяют для оптимизации или нормализации процессов пищеварения, повышения продуктивности и сохранности сельскохозяйственных животных [11].

Производство пробиотических кормовых добавок как биотехнологический процесс является трудоемким и дорогостоящим. При разработке кормовых добавок на основе микробного сырья важное значение имеет выбор питательной среды для культивирования микроорганизмов, обеспечивающий эффективное накопление бактериальной массы и безотходность технологии их производства [2]. Штамм бактерий B. subtilis в лабораторных условиях культивируют на синтетических твердых и жидких питательных средах, таких как мясопептонный агар (МПА), Гаузе № 2 агаризованная и мясопептонный бульон (МПБ). Однако недостатком указанных сред является их дороговизна и трудоемкий способ приготовления. В промышленных масштабах для получения кормовой добавки использование данных сред не является технологичным [9].

Целью данной работы является поиск компонентов питательных сред для культивирования штамма бактерий Bacillus subtilis , как основы обеспечения безотходной технологии получения кормовой добавки.

Материал и методы исследований. Исследования проводились в лаборатории по разработке микробных препаратов Якутского научноисследовательского института сельского хозяйства им. М.Г. Сафронова.

В качестве тест-штамма выбрали штамм бактерии B. subtilis ТНП-3, депонированный во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ ВГНКИ (Справка о депонировании от 08.08.2022 г. № 320 П). Данный штамм бактерии является одной из основ пробиотического препарата «Сахабактисубтил» [8].

Для проведения опытов приготовили следующие питательные среды, имеющие состав: 1) 3 %-ный отвар из семян яровой пшеницы с добавлением 1 % CaCO 3 ; 2) 3 %-ный отвар из семян яровой пшеницы с добавлением 1 % цеолита Хонгуринского месторождения (ТУ 2163-001-52483924-2006). В качестве контроля питательных сред использовали мясопептонный бульон.

Проведены исследования по определению концентрации минеральных компонентов - CaCO 3, и цеолита – Хонгурин, на рост B. subtilis . Исходя из которых выявлено оптимальное содержание минеральных составных: 1 г на 100 мл отвара пшеницы.

Зерновой отвар в качестве основы питательной среды готовили из соотношения 3 г измельченной пшеницы на 100 мл водопроводной воды. Кипятили в водяной бане 15 мин, затем фильтровали через сито. После отвар разливали в колбы, в которые добавили 1 г цеолита и 1 г CaCO 3 . Стерилизацию проводили при 1,1 атм. в течение 20 мин.

Для посева штамма бактерий B. subtilis ТНП-3 готовили суспензию по стандарту мутности бактериальных взвесей, равное 10 МЕ. Проводили посев 0,1 мл бактериальной суспензии на 100 мл среды. Культивирование производили в шейкер-инкубаторе «ES-20» при вращении со скоростью 240 об/мин, при температуре 37 °C в течение 72 часов.

Рост микроорганизмов на питательных средах оценивали количественным методом в соответствии с МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» [7]. Для определения количества бактерий в 1 мл провели 9-кратное разведение испытуемых сред в изотоническом растворе NaCl. Также в ходе опытов измеряли pH сред с помощью прибора Mettler Toledo Seven Easy и микроскопировали мазки, окрашенные по Граму. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием программы Microsoft Excel, по методу Стъюдента. Опыты проводили в 3-х кратной повторности.

Результат исследований.

Полученные образцы питательных сред имеют приятный запах пшеницы и желтоватый цвет. Питательная среда на основе пшеничного отвара с добавлением CaCO3 имела кремово-желтый цвет с небольшим количеством осадка, легко разбивающимся при встряхивании. Питательная среда, в которую добавили цеолит – Хонгурин, имела прозрачножелтый цвет с небольшим осадком цеолита.

В ходе экспериментов при культивировании штаммов бактерий B. subtilis ТНП-3 в термостате при температуре 37 °С, как на опытных питательных средах, так и на МПБ (контроль), наблюдали одинаковый рост без помутнения, с образованием на поверхности пленки и выпадением его в осадок при встряхивании, что характерно для аэробных спорообразующих бактерий. При микроскопировании были видны грамположительные споровые и вегетативные бациллы, посторонних морфологических форм не выявлено. Результаты культивирования штамма бактерии B. subtilis ТНП-3 в питательных средах приведены в таблице 1, а данные pH динамики сред – в таблице 2.

Таблица 1 – Динамика роста штамма бактерии B. subtilis ТНП-3

Примечание: * P>0,05

Таблица 2 – Динамика pH среды при культивировании B. subtilis ТНП-3

Как показывают данные (Таблица 1), число выросших колоний штамма бактерии B. subtilis ТНП-3 на 3 %-ном пшеничном отваре с 1 % цеолитом с первых суток выше, и количество их достоверно возрастает по мере культивирования по сравнению с другими вариантами опыта. Максимальная численность штамма бактерии B. subtilis ТНП-3 достигается на питательной среде на основе 3 % отвара пшеницы с добавлением 1% цеолита Хонгурин на 72 час роста, до 181±2,0 КОЕ*109/мл и превышает рост в контроле (МПБ) в КОЕ/мл на 43 %. У всех образцов питательных сред pH показатель нейтральный, что оптимально для культивирования микроорганизмов (Таблица 2).

При выборе компонентов питательной среды для штамма бактерии B. subtilis ТНП-3 основывались на литературных данных культивирования B. subtilis на зерновых культурах, как источника углеводов. Эти питательные среды на основе пшеничных отрубей и отваров, полусинтетическая питательная среда с добавлением соломы гречихи и ячменя, питательная среда на основе непророщенного зерна овса голозерного сорта – Немчиновский и другие [3, 15]. Результаты     проведенных     опытов подтверждают      данные      других исследователей, что зерновые питательные среды приемлемы для культивирования штаммов бактерий B. subtilis.

По литературным данным, мел (CaCO3) довольно часто используют в питательных средах для повышения роста микроорганизмов [15]. Цеолит, как минеральный компонент питательной среды культивирования штамма бактерии B. subtilis ТНП-3, использовался нами впервые. Цеолиты – природные минералы, относятся    к    группе    каркасных алюмосиликатов, их биологическая активность связывается с сорбционными свойствами [3, 4]. В опытах применяли цеолит Хонгуринского месторождения (ТУ 2163-001-52483924-2006), представляющий туф богатый макро- и микроэлементами, его часто применяют в местном      животноводстве      как нетрадиционную кормовую добавку [5]. Добавление цеолита – Хонгурин в питательную среду, на пшеничном отваре, значительно повысило рост штамма бактерий B. subtilis ТНП-3, по сравнению с культивированием на общепринятом мясопептонном бульоне и с добавкой мела.

Главным              отличием культивирования в 3 %-ном отваре пшеницы с добавлением 1 % цеолита является        прямое        внесение микроорганизмов      и      получения пробиотической кормовой добавки без утилизации среды, что обеспечивает безотходность технологии.

Заключение. Таким образом, полученные результаты исследований позволяют заключить, что среда на основе 3 % пшеничного отвара с добавлением 1 % цеолита – Хонгурина соответствует для культивирования пробиотического штамма бактерий B. subtilis ТНП-3 и является перспективной в разработке безотходной технологии получения кормовой добавки для сельскохозяйственных животных.