Разрешенная во времени флуоресценция триптофана как подход для выявления конформационных нарушений молекулы альбумина сыворотки крови при меланхолической депрессии

Депрессия является одной из наиболее распространенных болезней в контексте современности и входит в реестр основных причин потери трудоспособности в мире. Согласно оценкам The Institute for Health Metrics and Evaluation (IHME) [1], депрессию испытывает от 3,8% до 5% населения, в том числе 5,7% людей в возрасте старше 60 лет, так же более 10% беременных или родивших женщин в первые месяцы послеродового периода переживают депрессивное состояние [2].

По прогнозу экспертов ВОЗ, в период 20122030 гг. депрессия продолжает оставаться ведущей причиной инвалидизации в мире [3, 4]. Это заболевание представляет собой самую главную клиническую, психоэмоциональную и социальноэкономическую нагрузку на мировое сообщество. Депрессия является серьезным фактором риска, сопряженным с развитием и прогрессированием многих тяжелых соматических заболеваний [5]. Коморбидные депрессивные расстройства усугубляют течение соматической патологии и значительно повышают риск развития осложнений, инвалидности и преждевременной смерти.

Поэтому всестороннее исследование депрессии и патогенетических механизмов этого заболевания становится одной из главных задач медицинской науки. Прогнозирование и оценка эффективности лечения депрессии по важности выдвигаются на передний план [6, 7]. Предикция и оценка эффективности фармакотерапии расстройств депрессивного спектра являются первостепенной проблемой. Всё это требует разработки объективных методов для индивидуальной оценки эффективности терапии на ранних стадиях ан-тидепрессивной терапии.

Полученные нами ранее данные обнаружили, что при стрессе, расстройстве адаптации, шизофрении и ряде других патологических состояний изменяется конформация, соответственно деформируются физико-химические свойства транспортного белка крови – альбумина [8], представляющего собой главный (до 50% по массе) белок плазмы крови, выполняющий в организме важные функции. Альбумин, благодаря своим уникальным свойствам, сопрягает в организме множество метаболических процессов [9].

В молекуле альбумина сыворотки крови человека (АСЧ) имеется три флуоресцирующих аминокислотных остатка: триптофан, тирозин и фенилаланин. В качестве внутреннего флуоресцентного зонда белков наиболее часто используются аминокислотные остатки тирозина и триптофана. Флуоресценция триптофанового остатка особенно чувствительна к изменению структуры его окружения в белке. По этой причине триптофан используется как репортер структурных изменений белков, в частности альбумина. В ряде работ представлено, что в АСЧ есть в наличии только один остаток триптофана в положении 214 поли-пептидной цепи (Trp214) [10, 11].

Trp214 поглощает излучение при длинах волн от 295 до 305 нм, поэтому возбуждение в данной области позволяет селективно наблюдать не только за состоянием окружения Trp214, но также и за состоянием молекулы альбумина и его возможными конформационными изменениями.

Ранее нами с использованием специфического флуоресцентного зонда CAPIDAN (dimethylamino naphthalic acid N-carboxyphenylimide) и субнано-секундной флуоресцентной спектроскопии были выявлены конформационные изменения в альбумине сыворотки крови у больных с разнообразной психической патологией [12, 13]. В процессе реализации дальнейших исследований в этом направлении представлял интерес вопрос, может ли применение триптофановой флуоресценции определить конформационные изменения в молекуле альбумина сыворотки крови у больных меланхолической депрессией.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование кинетики затухания флуоресценции триптофана АСЧ у больных меланхолической депрессией с использованием субнаносе-кундной флуоресцентной спектроскопии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В основную группу исследования в соответствии с диагностическими критериями (The Criteria for Melancholic Features Specifiers, The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fourth Edition/Test Revision, DSM-IV-TR) включено 14 пациентов с меланхолической депрессией (МД). Актуальное психическое состояние больных согласно рубрикам МКБ-10 и ICD-10-CM оценивалось как депрессивный эпизод в рамках биполярного депрессивного расстройства (F31.3) или рекуррентного депрессивного расстройства (F33.1). Тяжесть заболевания оценивалась при помощи шкалы Гамильтона для депрессии (HAMD-21) [14]. В контрольную группу вошло 14 добровольцев, у которых не было выявлено болезненных изменений по результатам экспресс-диагностики клинико-психопатологического и клиникобиохимического исследования. По возрастным и половым показателям обследованные обеих (основной и контрольной) групп не имели статистически значимых различий

Количественная оценка аффективных нарушений проводилась с помощью психометрических шкал Гамильтона для оценки депрессии (HDRS-21) [14] и тревоги (HARS) [15]. Обследование проводилось в первый день госпитализации пациента в стационар до начала активного психофармакологического лечения.

Критериями исключения являлись расстройства шизофренического спектра, психотические включения в структуре депрессивного синдрома, актуальные суицидальные мысли и намерения, аддиктивные состояния, эпилепсия и эпилептиформные состояния в анамнезе, наличие деменции или обострения соматического или неврологического заболевания.

Все пациенты на момент госпитализации в отделение расстройств аффективного спектра Московского НИИ психиатрии по крайней мере на протяжении двух предыдущих недель не принимали препаратов с антидепрессивным и противо-тревожным действием.

Все включенные в исследовательскую выборку больные дали информированное согласие на участие в исследовании.

Процедура проведения . Из сывороток крови пациентов основной группы и добровольцев контрольной группы выделяли альбуминовую фракцию при помощи двухфазной системы ‒ полиэтиленгликоль 3000/фосфатно-солевой буфер (рН 6,4). Во всех фракциях были измерены концентрации альбумина с помощью метода бромкрезоловых красителей [16]. Среднеквадратическая ошибка среднего значения концентрации альбумина составляла 10%.

Альбуминовые фракции сывороток крови пациентов и добровольцев разбавляли в 10 раз фосфатно-солевым буфером (Sigma-Aldrich, США), содержащим 0,137 М NaCl и 0,01 М фосфата натрия, рН 7,4.

Измерения кинетики затухания флуоресценции были выполнены на установке с пульсирующим источником света (LED – Laser Emission Diode) фирмы Pico-Quant (Германия) [12]. Флуоресценцию Trp214 возбуждали быстрой вспышкой источником света (лазер) длительностью 7х10-10 сек. Длина волны возбуждения источником света в пике составляла 290±10 нм. На базе персонального компьютера с процессором AMD Sempron были автоматизированы как процесс измерения, так и обработка экспериментальных данных (программы TimeHarp и FluoFit фирмы Pico-Quant).

Обработка экспериментальных данных проводилась с помощью программы TimeHarp и FluoFit фирмы Pico-Quant (Германия). Статистическая значимость различий оцениваласт c использованием критерия Вилкокcона (для связанных выборок). Статистическую обработку полученных результатов проводили c использованием пакета программ Статистика 6.0 и Excel for Windows 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кинетика затухания флуоресценции триптофана описывается с использованием суммарной величины не менее трех экспонент:

F(t)=A1 exp(-t/t1)+A2 exp(-t/t2)+A3 exp(-t/t3)+..., где t – время, τi – постоянные времени затухания, Ai – величины амплитуд, пропорциональные количеству молекул Trp214 c данным временем затухания [17, 18].

Следует отметить, что если значения каждой из амплитуд Ai в формуле изменялись при различных условиях эксперимента, например, из-за заметных изменений ионной силы в исследуемом растворе, то значения времен затухания (τ) каждой компоненты оставались постоянными и находились в области (τ1 6,5; τ2 2,8 и τ3 1,0 нc соответственно) и определялись значениями трех амплитуд (A1, A2 и A3).

Перед измерением затухания флуоресценции Trp214 в каждой альбуминовой фракции проводили измерение кинетики затухания флуоресценции калибровочного раствора – раствора изомера L-триптофана в фосфатно-солевом буфере и этанола. Это позволяло сопоставлять значения интенсивности флуоресценции, измеренные в разные дни [17, 19].

Анализ всех параметров затухания флуоресценции Trp214 в пробах сыворотки крови обследованных обеих групп до начала терапии обнаружил, что средние величины амплитуд А1 и А3 в полученных образцах сыворотки крови пациентов с МД оказались статистически значимо (p=0,01) более низкими, чем у добровольцев контрольной группы. Использование теста Вилкок-сона для независимых выборок контрольной группы и пациентов с МД показало статистически значимые (p=0,01) различия между этими группами: для А1 – 440±12 против 378±5 и для А3 ‒ 327±15 против 285±7 соответственно. В то время как для величин амплитуд А2 не выявлено статистически значимых (p=0,1) различий между контрольной группой и пациентами с МД (585±16 и 576±18 соответственно). Дальнейший анализ обнаружил статистически значимые (p=0,01) различия в отношениях величин амплитуд А1/А3 (1,54±0,04 v 1,16±0,05) и A1/A2 (0,75±0,01 v 0,64±0,01 соответственно) между показателями добровольцев и пациентов с МД.

Что касается амплитуд Ai, то часть погрешности при их измерении могла быть обусловлена временной разницей хранения сывороток крови и условиями их измерения в разные дни. Доля погрешности могла быть значительно уменьшена, если оперировать не интенсивностью флуоресценции, а формой кривой затухания (в настоящей работе эти данные не приводятся). Форма кривой может характеризоваться соотношением амплитуд различных компонентов затухания, например величиной A1/A3. Эти данные получены во фракции альбумина, выделенной из образцов сыворотки крови обследованных обеих групп.

Выявленные незначительные изменения величин амплитуд могут трактоваться как следствие небольших колебаний концентрации альбумина во фракциях непосредственно при проведении процедуры выделения. Чтобы исключить этот концентрационный фактор, нами были использованы две процедуры.

Во-первых, во всех фракциях были измерены концентрации альбумина c помощью метода бpомкpезоловыx красителей. Составлялось отношение измеренной концентрации альбумина пробы к концентрации средней, нормальной сыворотки крови (45 г/л или 34 мкМ в кювете для измерения). Для подтверждения предположения линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации альбумина амплитуды каждой пробы приводились к средней интенсивности c учетом рассчитанных коэффициентов отношений. По этим данным выравнивали концентрации АCЧ в полученных пробах.

Во-вторых, было использовано соотношение величин амплитуд A1/A3 и A1/A2, которое практически не зависит от концентрации АCЧ. Как видно, соотношение амплитуд оказалось весьма чувствительным показателем эндогенной депрессии. Среднее значение показателя A1/A3 характеризуется статистически значимыми (p=0,01) различиями. Но что еще более важно – область перекрывания значений отношения добровольцев контрольной группы и пациентов с МД мала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые в литературе было показано, что конформационные изменения молекулы альбумина при психической патологии (меланхолическая депрессия) могут быть выявлены при помощи субнаносекундной флуоресцентной спектроскопии флуоресцирующих остатков триптофана. Были получены статистически значимые (p=0,01) различия для амплитуд (А1, А3) и отношений А1/А3 и A1/A2. При этом величины амплитуд затухания флуоресценции у больных были ниже величин амплитуд для альбуминовых фракций у добровольцев контрольной группы. Полученные результаты исследования подтверждают, что флуоресценция Trp214 имеет связь с изменениями в структуре молекулы альбумина при психических заболеваниях.