Разрушение спор и вегетативных клеток тетродотоксин-продуцирующей бактерии Bacillus sp. 1839

Материалы и методы. Бактерии штамма Bacillus 1839 были взяты из коллекции морских гетеротрофных микроорганизмов ИБМ ДВО РАН и культивированы при 23^оС в течение 7 суток на среде Йошимицу–Кимура следующего состава: пептон (5,0 г), дрожжевой экстракт (2,0 г), глюкоза (1 г), К 2 НРО 4 (0,2 г), MgSO 4 х 7H 2 O (0,1 г), агар (12,0 г), дистиллированная вода (500 мл), и морская вода (500 мл); рН среды 7,8–8,0. По истечению 7 суток производили смыв бактерий с твердой среды, используя 1% фосфатный буфер, следующего состава: NaCl (9,0 г), KCl (0,1 г), Na 2 HPO 4 (1,65 г), KH 2 PO 4 (0,083 г), дистиллированная вода (50 мл), pH 7,4. Полученную суспензию использовали в дальнейших экспериментах для разрушения спор. Перед каждым экспериментом осуществляли контрольную оценку состояния спор и бактериальных клеток на временных препаратах, а также производили подсчет процентного соотношения спор и вегетативных клеток. Для этого изготавливали мазки и окрашивали препараты по методу Пешкова. Бактериальные препараты анализировали на световом микроскопе (IX83, Olympus, Япония).

Для разрушения спор термическим шоком из суспензии бактерий отбирали аликвоты по 1 мл, помещали их на 15 мин и 30 мин в автоклав (TUT-2540EKA, Tuttnauer, Израиль), со следующими условиями: температура 121оС и давление 21 атм. После прохождения указанного времени производили оценку состояния спор и бактериальных клеток.

Для разрушения спор холодовым шоком суспензию бактерий помещали в низкотемпературный холодильник (MDF-U73V, Sanyo, Япония) при -80оС и оставляли на 1 ч и на 24 ч. По прошествие указанного времени бактерий размораживали, проводили оценку состояния клеток.

Для разрушения спор этиловым спиртом из суспензии бактерий отбирали две аликвоты по 100 мкл и доводили их до 1 мл 70% и 95% этанолом, соответственно. Образцы оставляли на шейкере (MSV-3500, Biosan, Латвия) 1100 об/мин, на 15 мин, 1 ч, 3 ч и 21 ч; через соответствующее время производили оценку состояния клеток.

Для ультразвукового разрушения спор суспензию клеток помещали в ультразвуковой гомогенизатор (HD 2070, Bandelin Sonopuls, Германия) и производили ультразвуковое воздействие (20 kHz, амплитуда 228 мкм, рабочий цикл 0.8 с интервалом 0.2 с) периодами по 10 мин. После каждого периода проводили оценку состояния клеток.

Результаты. Представленные в норме клетки имели хорошо прокрашенную цитоплазму с четко выраженной клеточной стенкой (рис. 1А). Вегетативные клетки были представлены палочками, (средняя длина - 2,68 мкм, средняя ширина - 0,41 мкм), споры имели яркое гомогенное окрашивание интенсивно голубого цвета с хорошо выраженной коккобациллярной формой (ср. длина - 1,11 мкм, ср. ширина - 0,56 мкм). Сильные морфологические изменения у вегетативных клеток и спор вызывал термический шок при 121оС и 21 атм. По истечению 15 мин в автоклаве у большинства вегетативных клеток клеточная стенка была бледно окрашенной, цитоплазма либо не окрашивалась, либо окрашивалась слабо, размеры и форма клеток также менялись - клетки становились более широкими (ср. длина - 2,64 мкм, ср. ширина - 0,68 мкм) (рис. 1Б). Большая часть спор имела то же строение, что и в норме: короткие палочки с интенсивно окрашенным содержимым. Часть спор была видоизменена: внутреннее содержимое имело менее интенсивное окрашивание по сравнению с контролем (рис. 1В). По прохождении 30 мин в автоклаве все клетки приобрели очень бледную окраску цитоплазмы и бледную окраску клеточной стенки, спор обнаружено не было.

Холодовой шок при минус 80оС в течение 1 часа и 24 часов не привел к разрушению спор и бактериальных клеток. По прохождению 24 ч существенных морфологических изменений клеток и спор по сравнению нормой не было выявлено. Соотношение спор и клеток спустя 24 ч незначительно отличалось от контроля и находилось в пределах допустимой погрешности.

При обработке бактериальной культуры этанолом морфологические особенности клеток и спор не подвергались заметным изменениям даже спустя максимальное время в 70% и 95% этиловом спирте и оставались схожими с контролем. После обработки 70% этанолом в течение 21 ч соотношение спор и клеток слабо изменилось и составило 41,3% спор, 2,0% эндоспор и 56,7 % клеток, в то время, как перед началом эксперимента соотношение в бактериальной культуре было следующим: 49,1% спор, 0,2% эндоспор и 50,7% клеток. При обработке бактерий 95% этанолом спустя 21 ч относительное количество спор и клеток осталось практически на уровне начала эксперимента (47,2% спор и 48,1% клеток), а соотношение эндоспор заметно увеличилось и составило 4,6%.

При ультразвуковом воздействии уже на 10-й минуте в вегетативных клетках становились заметны деструктивные изменения: часть клеток приобретала неправильную форму с изрезанными границами (рис. 1Г), у некоторых бактерий происходил выход внутреннего содержимого (плазмодия) из клеточной оболочки (рис. 1Д), клеточная оболочка при этом слабо окрашивалась в розоватый цвет, а вышедший плазмодий был ассоциирован с клеточной стенкой и был окрашен в интенсивно синий гомогенный цвет. На 20-й минуте ультразвукового разрушения подобные изменения наблюдались уже у большинства бактериальных клеток. При ультразвуковой дезинтеграции более 30 мин деструктивные трансформации становились заметны и в спорах: наравне с нормально выраженными спорами были выявлены структуры, имеющие различную неправильную форму и небольшой размер (ср. длина - 0,73 мкм, ср. ширина - 0,34 мкм) (рис. 1Е) и, по всей видимости, являющиеся фрагментами разрушенных спор. Однако, полного разрушения бактериальной культуры (как вегетативных клеток, так и спор), удалось добиться только спустя 70 минут ультразвукового воздействия при данных условиях.

Рис. 1 . Бактериальные клетки Bacillus sp. (1839), окрашенные по методу Пешкова, световая микроскопия:

А – бактериальные клетки в норме (400 Х). Вставка – свободные споры (белая стрелка) и эндоспоры (черные стрелки) (1000 Х). Б – бактериальные клетки (стрелки), подверженные термическому шоку при 121оС и 21 атмосфере в течение 15 минут (500 Х). В – бактериальные клетки (стрелки), подверженные термическому шоку при 121оС и 21 атмосфере в течение 15 минут: часть спор имеют нормальное строение (черная стрелка), часть спор разрушена (белая стрелка) (1200 Х). Г – Бактериальная культура, обработанная ультразвуком в течение 10 мин.: часть вегетативных клеток (черная стрелка) имеют деструктивные изменения (1000 Х). Д - Бактериальная культура, обработанная ультразвуком в течение 10 минут. Выход плазмодия из клеточной стенки (стрелка) (1000 Х). Е -Бактериальная культура, обработанная ультразвуком в течение 30 минут, деструктивные изменения в вегетативных бактериальных клетках и в спорах (1000 Х).

Обсуждение. Среди всего многообразия методов разрушения спор и вегетативных бактериальных клеток лишь довольно небольшое число подходов являются доступными в промышленности и в домашних условиях. Тем не менее, такие методы, как термический и холодовой шок, спиртовая дезинфекция и ультразвуковая дезинтеграция, были выбраны нами, поскольку их эффективность в разрушении или нейтрализации спор Bacillus была отмечена во многих работах [9, 10]. Этиловый спирт - это наиболее популярный дезинфектант, который, как правило, всегда используется для дезинфекции рабочих поверхностей, так как считается, что он высокоэффективно вызывает гибель бактериальных клеток [11]. Проведенные нами исследования по разрушению бактериальной культуры Bacillus 1839 этиловым спиртом в концентрации 70% и 95% в условиях длительного культивирования показали неэффективность этого метода, поскольку обработка этанолом не привела к разрушению, как спор, так и вегетативных клеток. По всей видимости, бактерии и споры штамма Bacillus 1839, как и многие другие штаммы рода Bacillus, обладают резистентностью к этиловому спирту различной концентрации.

Еще одним распространённым способом разрушения клеточной культуры в микробиологии является воздействие низкой температуры. Деструктивные изменения в этом случае происходят в клетках за счет формирования кристаллов льда, которые разрывают биологический объект. Эксперименты, проведенные нами при температуре минус 80оС не выявили разрушения как вегетативных клеток, так и их спор. Возможно, отсутствие разрушений в спорах связанно с принципом действия льда, как разрушающего агента: поскольку споры являются дегидратированными структурами, практически полностью лишенными воды, то низкая температура не может привести к формированию кристаллов льда, а, следовательно, и к разрушению спор. Однако причины отсутствия разрушений в вегетативных клетках остаются неясными и требуют дальнейших исследований.

Наиболее эффективными методами полного разрушения клеточной культуры Bacillus выступили термошок, обусловленный сочетанием повышенной температуры и давления, и ультразвуковая дезинтеграция. Разрушение бактерий и спор при температуре 121^оС и давлении 21 атм происходило в течение 30 мин, в то время как ультразвуковое воздействие при частоте 20 kHz достигало подобного результата в течение 70 мин. Полученные нами результаты свидетельствует о перспективности использования сочетания повышенной температуры и давления для разрушения спор Bacillus 1839 с целью дезинфекции продуктов, потенциально загрязненных ТТХ-продуцирующими бациллами. Тем не менее, открытым остается вопрос сохранения активности токсина при данных условиях, поскольку неизвестно, вступает ли ТТХ в химические взаимодействия при подобной температуре и давлении. Дальнейшие наши исследования будут направлены на выяснение активности ТТХ, полученного при разрушении спор с помощью термического шока и ультразвуковой дезинтеграции.

Исследование выполнено при поддержке ДВФУ, проект №14-08-06-19_и. Работа поддержана грантом Программы фундаментальных научных исследований «Дальний Восток» №15-I-3-036.