Реакция эритроцитов крыс на ступенчатую плавательную нагрузку и тест «до отказа» в термонейтральной среде

Эффекты физических нагрузок универсальны и оказывают воздействие на все процессы в организме, влияя на их направленность [22]. При этом морфологическая модификация эритрона [25] сопровождается увеличением количества эритроцитов, высокорезистентных полихроматофильных, обратимо измененных форм клеток [12] и содержанием гемоглобина в крови [6, 7] в связи с необходимостью экстренного восполнения дефицита кислорода [28, 32]. В течение длительных физических упражнений повышенная пролиферативная активность ретикулоцитов [3] с их метаболической активностью и высокой трансформационной способностью [8, 27] ускоряет процесс обновления красной крови и способствует повышению физической работоспособности организма [2]. Постепенно возрастающая физическая нагрузка обеспечивает торроидальность эритроцитов, то есть их наиболее эффективное движение в сосудистом русле крови [16], при этом существенно разнообразие диаметра эритроцитов и их концентрация в крови в норме не менее 3,5-4,0×106 в 1мм3 [23]. Соответствие количества эритроцита с их диаметром у человека и животных имеет диагностическое значение [13], поскольку функционально изменение величины эритроцитов связано с оксигенацией [9] и их сорбционной способностью [15]. Соотношение этих параметров в условиях оптимального уровня эритроцитарного пула дает возможность адекватной оценки реакции системы крови на физическую нагрузку.

Материал и методы исследований. Исследование проводили на половозрелых самцах крыс Wistar с массой тела 250-300 г. Животных содержали по четыре особи в клетке на стандартном рационе вивария, со свободным доступом к воде, при температуре 21±1 °С и 12-часовом освещении. В контрольную группу были включены животные, содержавшиеся на стандартном рационе в условиях вивария ВивК (n=10) и животные экспериментальных групп Плав4 % (n=8) и Плав4 %Т (n=8). Животные группы Плав4 % после предварительной адаптации к воде [24] плавали с грузом 4 % от массы тела, однократно, «до отказа». Плавание животных группы Плав4 %Т также начинали с их адаптации к условиям эксперимента [29], в ходе которой время нахождения крыс в десатурированной воде с температурой +34-36 °С в непрозрачной емкости глубиной 60 см в течение первых 5 дней постепенно увеличивалось с 2-х до 4х минут без нагрузки. Нагрузочное тестирование животных выполняли по 4 мин ежедневно с 6-го по 40 день [29] с модификациями, заключавшимися в постепенном увеличении массы груза с 0 до 4 % массы тела и последующем выполнении плавательного теста «до отказа». Определение полного утомления во время плавательного теста «до отказа» у животных представлено в работе [19]. В крови, стабилизированной гепарином (5000

ед/мл, АКОС, Россия), определяли уровень гемоглобина по Сали ГС-3, гематокрита с использованием центрифуги MPW-310 («Mechanika Precyzyina», Poland), количество эритроцитов в камере Горяева и ретикулоцитов на мазках после инкубирования крови в течение 12-15 мин с 1% раствором бриллиантового крезилового синего. Измеряли диаметр 100 эритроцитов, окрашенных по Романовскому-Гимза (Vital-Development, Россия) с помощью микроскопа PZO (Poland) с масляной иммерсией, увеличение об. 100х ок. с градуированной шкалой 12х [17], с дальнейшим построением кривой Прайс-Джонса [31]. Значимость различий реакций клеток крови у исследованных групп животных определяли с использованием критерия Крускала-Уоллеса, учитывали средние величины показателей (M) и ошибку средней (m).

Различия считались значимыми при Р≤0,05. Рассчитывали коэффициент ранговой корреляции по Спирмену [5].

Результат исследований. Влияние ступенчатой плавательной нагрузки у животных в группе Плав4 %Т проявилось в отсутствии значимых изменений в эритроцитарном составе крови по сравнению с группой ВивК, за исключением снижения концентрации гемоглобина в эритроците (Р≤0,001). У животных группы Плав4 %Т по сравнению с животными группы Плав4% отмечено двукратное увеличение времени плавания (Р≤0,05), уменьшение диаметра эритроцитов (Р≤0,01), их объема (Р≤0,05), содержания гемоглобина в эритроците (Р≤0,05), относительного (Р≤0,05) и абсолютного количества ретикулоцитов (Р≤0,01) (Таблица 1).

Таблица 1 – Время плавания и клеточный состав красной крови крыс в тесте «до отказа» (M±m)

Показатель	ВивК	Плав4%	Плав4%Т
Время плавания, мин	0	91,16 ± 32,15	184,75 ± 23,67•
Гематокрит, %	44,84 ± 0,33	49,49 ± 0,81	46,58 ± 1,76
Гемоглобин, г/л	144,90 ± 1,22	148,13 ± 2,24	141,12 ± 4,69
Эритроциты, 1012/л	8,16 ± 0,16	7,29 ± 0,19**	7,79 ± 0,32
Диаметр эритроцитов, мкм	6,18 ± 0,02	6,40 ± 0,03***	6,21 ± 0,04••
Площадь поверхности эритроцитов, мкм2	74,03 ± 0,66	79,45 ± 0,69***	78,29 ± 1,97
Площадь поверхности эритроцитов, м2/л	601,42 ± 9,85	579,10 ± 14,86	602,10 ± 23,60
Объем эритроцитов, мкм3	55,08 ± 0,97	68,57 ± 2,60***	59,41 ± 2,17•
Содержание гемоглобина в 1 эритроците, пг	17,79 ± 0,03	20,42 ± 0,62**	18,03 ± 0,74•
Концентрация гемоглобина в 1 эритроците, %	32,31 ± 0,28	29,94 ± 0,33**	30,34 ± 0,29***
Ретикулоциты, 1012/л	0,10 ± 0,01	0,16 ± 0,02*	0,09 ± 0,01••
Ретикулоциты, ‰	12,61 ± 0,65	19,52 ± 2,93*	11,59 ± 1,41•
Эритроциты в диапазоне 6,0-6,3 мкм, %	40,40 ± 2,68	26,00 ± 2,51**	34,31 ± 4,50
Ретикулоциты 1-2 группы в диапазоне 6,4-6,7 мкм, %	45,85 ± 1,20	44,88 ± 2,26	45,00 ± 2,36
Ретикулоциты 3-4 группы в диапазоне 6,4-6,7 мкм, %	34,50 ± 6,51	39,75 ± 2,66	39,63 ± 1,38

Примечание: различия значимы * - P≤0,05, ** - P≤0,01, *** - P≤0,001 по сравнению с группой ВивК; • - Р≤0,05, •• - Р≤0,01, •••-Р≤0,001 – по сравнению с группой Плав4%

Распределение эритроцитов по диаметру с максимальным их количеством в диапазоне 6,0-6,3 мкм показало тенденцию к правостороннему сдвигу кривой Прайс-Джонса на 24,2% относительно животных группы Плав4% (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Кривая Прайс-Джонса встречаемости эритроцитов в периферической крови крыс контрольной и экспериментальных групп

Независимо от характера физической нагрузки у молодых эритроцитов с максимальным относительным их количеством в диапазоне 6,4-6,7 мкм, в отличие от зрелых эритроцитов, сдвиг в кривой Прайс-Джонса не выявлен (Рисунок 2).

Отмечено значимое влияние постепенно возрастающей плавательной нагрузки у крыс на взаимосвязь количества эритроцитов разной степени зрелости с их площадью поверхности (Таблица 2).

Рисунок 2 – Кривая Прайс-Джонса встречаемости ретикулоцитов в периферической крови крыс контрольной и экспериментальных групп

Таблица 2 – Значение коэффициента корреляции между эритроцитарными показателями у животных исследуемых групп

Показатель	ВивК Viv	Плав4% Swim4%	Плав4%Т Swim4%T
Parameters	Площадь поверхности эритроцитов, мкм2 RBC area surface, µm2
Эритроциты, 1012/л RBC, 1012/l	-0,224; р=0,514	-0,244; р=0,540	-0,714; р=0,048
Эритроциты, мкм3 RBC, µm3	0,164; р=0,632	0,232; р=0,540	-0,262; р=0,501
Ретикулоциты, 1012/л RET, 1012/l	Площадь поверхности ретикулоцитов, мкм2 RET area surface, µm2
	-0,309; р=0,368	0,727; р=0,048	-0,899; р=0,004

В     условиях

Ретикулоциты 3-4 группы зрелости, по ступенчатой

плавательной нагрузки двукратное сравнению с ретикулоцитами 1-2 групп увеличение времени плавания животных в группе Плав4%Т по сравнению с группой Плав4%, по-видимому, является проявлением общей закономерности повышения работоспособности организма [11]. Известно, что адекватные физические нагрузки способствуют нивелированию стресс-реакции [19] и поддержанию оптимального уровня оксидативной системы организма животных [1], повышению насыщения крови кислородом, за счет снижением концентрации гемоглобина в эритроците [30]. В свою очередь, уменьшение гипоксического эффекта оказывает влияние на характер трансформации эритроцитов [21]. У животных Плав4%Т тенденция к снижению относительного количества эритроцитов в диапазоне 6,0-6,3 мкм (правосторонний сдвиг кривой Прайс-Джонса) менее выражена чем у животных в группе Плав4% (Таблица 1, Рисунок 1А). Полагаем, что уменьшенный сдвиг кривой Прайс-Джонса при ступенчатой физической нагрузке может быть связан с изменением кислотно-щелочного равновесия циркулирующей крови [31]. Независимо от характера физической нагрузки у молодых эритроцитов с максимальным относительным их количеством в диапазоне 6,4-6,7 мкм (в отличие от зрелых эритроцитов), отсутствие сдвига кривой Прайс-Джонса, может быть связано с их бо́льшей устойчивостью к изменениям внутренней среды и ускоренным созреванием [10].

зрелости, проявляют тенденцию к снижению их относительного количества в данном диапазоне и при этом теряют до 1014% площади мембран в процессе везикуляции [26]. Наличие корреляционной связи между количеством эритроцитов и величиной их площади поверхности (-0,714, р=0,048) у крыс группы Плав4%Т может являться следствием включения механизма регуляции поверхности эритроцитарных клеток в крови, которая, согласно исследованиям А.Л. Чижевского [23], находится в эквивалентной зависимости от поверхности всех капилляров. Известно, что у представителей грызунов отношение количества эритроцитов – 6,9×1012/л к их диаметру – 6,0-7,9 мкм близко к 1,0 [14]. Поэтому у крыс взаимосвязь величин этих параметров может быть менее выражена по сравнению с копытными животными и птицами, имеющими более высокие и низкие коэффициенты – 2,9 и 0,03 соответственно. Разный характер проявления корреляционной связи между количеством ретикулоцитов и величиной их площади поверхности у экспериментальных животных, возможно, обусловлен реактивностью функционально неравнозначных эритроцитов на изменение факторов среды и вариабельностью их диаметра в циркулирующей крови [18, 20]. Отсутствие корреляции между площадью поверхности эритроцитов, обеспечивающей сорбционную функцию [4] и изменением их объема, связанного с диссоциацией гемоглобина [30] в покое или после физической нагрузки, может быть результатом изменения площади поверхности эритроцита в процессе его набухания, прежде всего, среди нормоцитов, активно реагирующих на изменение среды [21]. Предполагаем, что характер набухания эритроцита также может обусловливать появления положительной или отрицательной корреляционной связи между анализируемыми показателями.

Заключение. Полученные результаты отражают морфофункциональное состояние красной крови у животных в зависимости от интенсивности плавательной нагрузки. Установлено, что у крыс постепенное увеличение плавательной нагрузки в термонейтральной среде способствовало незначительному правостороннему сдвигу кривой Прайс-Джонса, снижению концентрации гемоглобина в эритроците и отсутствию ретикулоцитоза. Изменения в эритроцитарном составе могут свидетельствовать об адаптивном ответе, связанном со снижением функциональной напряженности транспортной системы крови при двукратном увеличения времени плавания, по сравнению с идентичной, но однократной нагрузкой в тесте «до отказа». Полагаем, что физическая нагрузка способствует проявлению механизма, регулирующего соответствие количества эритроцитов (в том числе и ретикулоцитов) с величиной их площади поверхности в процессе эритропоэза.

Резюме

Целью работы явилось определение адаптационной реакции клеток красной крови у крыс после 40 дней возрастающей плавательной нагрузки до 4% от массы тела в термонейтральной среде в тесте «до отказа». Показано, что у животных в результате выполнения ступенчатой физической нагрузки двухкратное увеличение предельного времени плавания сопровождалось снижением концентрации гемоглобина в эритроците, отсутствием ретикулоцитоза и незначительным сдвигом распределения эритроцитов кривой Прайс-Джонса в диапазоне 6,0-6,3 мкм. Предполагаем, что наличие корреляции между количеством эритроцитов и их диаметром может свидетельствовать о проявлении механизма, регулирующего это соотношение. Изменения в эритроцитарном составе, связанные со снижением функциональной напряженности транспортной системы крови по сравнению с идентичной, но однократной нагрузкой в тесте «до отказа», могут являться маркерами физиологически обоснованного адаптивного ответа на ступенчатую физическую нагрузку.