Реакция различающихся по агрессивности географических изолятов Phoma macdonaldii Boerema на изменение температуры и освещённости в контролируемых условиях среды

Введение. Повсеместная интенсификации возделывания подсолнечника в РФ в последние десятилетия способствовала распространению фомоза (рис. 1), возбудителем которого является Phoma macdonaldii Boere-ma [1; 2].

В зависимости от степени развития поражения продуктивность растений подсолнеч- ника может существенно снижаться. Имеются сообщения, что потери урожая в разных странах могут составлять от 30 до 70 % [3; 4; 5; 6]. В течение одного периода вегетации подсолнечника может проходить несколько циклов развития гриба, что усугубляет проблему. Решение её может быть достигнуто созданием толерантных к фомозу генотипов подсолнечника. В этой связи актуально изучение биологических свойств изолятов Ph. macdonaldii с целью выявления критериев агрессивности для растений подсолнечника. Наиболее агрессивные формы гриба необходимо использовать в селекционных программах при создании гибридов подсолнечника, устойчивых к этому патогену.

Рисунок 1 – Поражение фомозом стеблей подсолнечника в Краснодарском крае (ориг.)

Целью наших исследований было сравнение географических изолятов Ph. macdonaldii , различающихся по степени агрессивности, по их способности к формированию органов пик-нидиального размножения и интенсивности радиального роста колоний при разных температурах и освещённости в контролируемых условиях среды.

Материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории иммунитета и молекулярного маркирования ВНИИМК. Фрагменты поражённых растений подсолнечника были собраны в разных регионах РФ: Краснодарском, Ставропольском краях, Ростовской и Волгоградской областях. Выделение из них возбудителя фомоза и получение моноспоро-вых культур проводили с использованием общепринятой методики экспериментальной икологии на овсяной агаризованной среде (ОА) [7; 8]. Для поверхностной стерилизации пораженных фрагментов растений объект выдерживали в 2 %-ном растворе марганцовокислого калия в течение 1–5 мин и многократно промывали стерильной водой. Пораженные части растения размером до 1,0 см стерилизовали в 96° спирте, обжигали и высевали на среду. Первичное выделение в культуру, как и пересевы исследуемых изоля-тов, производили на питательной среде ОА с рH 6,0. Питательную среду (ОА) готовили следующим образом: 150–200 г овсяных зерен варили в одном литре воды в течение 20 мин, сцеживали отвар, добавляли в него 20 г глюкозы и 20 г агара. Автоклавировали при 1,2 атм. 30 мин. Перед разливом в чашки Петри добавляли антибиотик широкого спектра про-тивобактериального действия бициллин. Выращивали культуры при температурном режиме 20–25 оС. Морфолого-культуральные признаки выделенных изолятов соответствовали возбудителю Ph. macdonaldii, вызывающему черную стеблевую пятнистость (фомоз) на подсолнечнике. Моноспоровые культуры изолятов получали методом разбавления. Для этого некоторое количество мицелия или пикнид с пикноспорами стерильной иглой переносили в пробирку со стерильной водой, тщательно встряхивали для их равномерного распределения. Суспензию наносили на разлитую тонким слоем (2 мм) в чашки Петри и застывшую среду ОА и распределяли равномерно шпателем. Затем чашки Петри герметично закрывали и ставили в термостат при температуре, оптимальной для прорастания пикноспор гриба, – 22–25 °С. Развившийся из одной споры мицелий с кусочком агара переносили в колбы на стерильные семена подсолнечника и помещали в термостат на 14 дней. Полученную моноспоровую культуру (изолят) пассировали на ОА. Для определения патогенных свойств в чашки Петри с 14-дневной моноспоровой культурой каждого изолята раскладывали отсечённые семядольные листья и фрагменты гипокотиля 10дневных растений четырех генотипов подсолнечника. Повторность 4-кратная, по два семядольных листа и два фрагмента гипокотиля в каждой чашке Петри. В контрольном варианте семядольные листья и фрагменты гипокотиля раскладывали на чистую питательную среду. Агрессивность изолятов определяли по 163

соотношению размера поражённой поверхности семядольных листьев и гипокотилей к общей их площади в процентах.

В качестве объектов дальнейших исследований были выбраны семь изолятов гриба, различающихся происхождением и агрессивностью. Анализировали интенсивность радиального роста колоний и формирование пикнид этих изолятов при температурах 15, 20, 25, 30 оС в темноте и при круглосуточном освещении. Повторность 4-кратная.

Результаты и обсуждение. Степень патогенности (агрессивность) грибов может быть связана с продолжительностью периода от заражения до образования потомства и количеством генераций в течение одной вегетации растений-хозяев [10]. В этой связи интенсивность роста мицелия гриба в культуре и продолжительность периода до начала формирования пикнид может быть косвенным показателем его агрессивности.

Сравнение моноспоровых изолятов Ph. macdonaldii разного географического происхождения по их способности колонизировать поверхность отсечённых семядолей и фрагментов гипокотилей, размещённых на поверхности колоний гриба, показало, что наиболее агрессивными были изоляты № 1 из Ставропольского края (70 % колонизированной поверхности) и № 6 из Краснодарского края (75 %). Наименьшей агрессивностью характеризовались изоляты № 5 (20 %) и № 7 (30 %) из Краснодарского края. Средними по агрессивности проявили себя изоляты № 2 (50 %) из Ростовской и № 4 (60 %) из Волгоградской областей.

Таблица 1

Агрессивность изолятов Phoma macdonaldii разного географического происхождения

Изолят, №	Выделен из:	Место сбора: область, край	*Агрессив-ность
1	стебля	Ставропольский	70
2	-//-	Ростовская	50
3	-//-	Краснодарский	40
4	семян	Волгоградская	60
5	стебля	Краснодарский	20
6	-//-	Краснодарский	75
7	-//-	Краснодарский	30

*– процент колонизированной поверхности отсечённых семядольных листьев и фрагментов гипокотилей 10-дневных растений подсолнечника через двое суток их пребывания в контакте с колониями гриба

□ - в темноте ш - при освещении

Рисунок 2 – в лияние температуры на диаметр колоний Ph. macdonaldii (10-й день выращивания) в темноте и при освещении

Это согласуется с данными других авторов, изучавших Ph. macdonaldii во Франции [11].

Условия выращивания повлияли на культуральные свойства одного и того же изолята. Культуры отличались цветом, плотностью мицелия, его структурой и наличием или отсутствием пикнид (рис. 3).

а                        б

а                          б

Рисунок 3 – Колонии гриба одного изолята Ph. macdonaldii из Ростовской области, выращенные при температуре 15 °С (слева) и 25 °С (справа), а – в темноте;

б – при освещении (ориг.)

Значительное варьирование по интенсивности роста в культуре наблюдалось у каждого изолята в зависимости от температуры (рис. 4).

Рисунок 4 – Диаметр колоний изолятов Ph. macdonaldii на 10-й день выращивания в темноте и при круглосуточном освещении при разных температурах

Так, изолят № 6 из Краснодарского края существенно отличался высокой интенсивностью роста мицелия при освещении во всех температурных режимах. Слабый радиальный рост мицелия отмечен у других изолятов из Краснодарского края (№ 3, 5 и 7), с агрессивностью 40, 20 и 30 % соответственно. При этом установлена взаимосвязь интенсивности радиального роста колоний гриба при круглосуточном освещении всех изолятов с их агрессивностью, которая усиливалась с повышением температуры, и при 30 оС коэффициент корреляции (r) равнялся 0,83. Это свидетельствует о том, что радиальный рост колоний в культуре при 30 оС в условиях круглосуточного освещения может быть одним из критериев выбора наиболее агрессивного изолята для использования его в качестве инокулята при селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу. В темноте взаимосвязь этих признаков менялась в зависимости от температуры и варьировала от слабой отрицательной до слабой положительной. В условиях темноты и температуры 30 оС коэффициент корреляции между интенсивностью радиального роста колоний и агрессивностью изолятов был чуть выше среднего положительного значения и составлял 0,58.

Начало образования пикнид зависело и от температуры, и от освещённости. Если при температурах 20 и 25 °С у всех изолятов пикниды формировались на четвертый день, независимо от освещения, то при 15 и 30 °С начало их образования на свету приходилось на седьмой, а в темноте – на десятый день. В условиях освещения и температуры 25 °С у всех изолятов сформировалось значительно большее количество пикнид, чем при других режимах (табл. 2).

Таблица 2

Влияние температуры и освещённости на образование пикнид в колониях гриба Ph. macdonaldii на 15-й день культивирования

Изо-лят №	Количество пикнид, шт/см2.
	15 оС		20 оС		25 оС		30 оС
	свет	тем нота	свет	тем нота	свет	тем нота	свет	тем нота
1	57	6	163	46	230	137	70	41
2	201	40	229	159	291	257	30	5
3	41	14	189	176	217	192	91	40
4	103	2	185	137	285	210	49	30
5	49	5	86	93	181	153	75	6
6	45	21	252	13	395	130	81	27
7	24	1	36	18	96	90	30	4
НСР 05	18,1		35,2		30,9		24,1

При температуре 15 °С у изолятов из Ростовской (№ 2) и Волгоградской (№ 4) областей, с агрессивностью 50 и 60 % соответственно, количество пикнид на свету значительно превысило таковое у остальных. Меньшим количеством пикнид при всех изученных температурных условиях отличался изолят № 7. Максимальное количество пикнид на 1 см2 питательной среды у него сформировалось при 25 оС и составило 96 при освещении и 90 в темноте.

У наиболее сильного по агрессивности изолята № 6 из Краснодарского края количество пикнид было максимальным (395 шт. на 1 см2) при температуре 25 оС.

Выводы. Таким образом, определена оптимальная температура для интенсивного радиального роста колоний изолятов Ph. macdonaldii из разных регионов РФ: как на свету, так и в темноте она составила 25 ^оС. Большее количество пикнид (существенное при 5 %-ном уровне значимости) у изученных изолятов гриба образовалось при круглосуточном освещении, независимо от их агрессивности. Скорость радиального роста колоний Ph. macdonaldii в условиях круглосуточного освещения при 30 ^оС коррелировала с агрессивностью и может служить при таких режимах культивирования критерием отбора наиболее агрессивных форм гриба. Однако это необходимо проверить на большем количестве изолятов.