Рецепторная природа кардиопротекторного эффекта каннабиноидов при ишемии и реперфузии изолированного сердца

Общеизвестно, что за открытием ацетилхолина и катехоламинов последовало открытие их рецепторов. В случае эндоканнабиноидов события развивались прямо противоположным образом: сначала открыли каннабиноидные (СВ) рецепторы, а затем их эндогенные агонисты [9]. Каннабиноидные рецепторы первого типа (CB1) имеются на эндотелиальных клетках артерий и капилляров [13], а также на нервных окончаниях симпатических нервов, иннервирующих сердце [10]. Каннабиноидные рецепторы второго типа (CB2) находятся в кардиомиоцитах и эндотелиальных клетках артерий [13]. Установлено [8], что в миокарде синтезируются эндогенные кан- набиноиды – анандамид и 2-арахидонилглицерол, однако их роль в регуляции функционального состояния сердца изучена недостаточно. Единичные работы свидетельствуют о том [1, 12, 14, 17], что экзогенно вводимые каннабиноиды повышают устойчивость сердца к действию ишемии-реперфузии. Так, нами было показано, что активация СВ-рецепторов оказывает кардиопротекторный эффект в условиях коронароокклюзии и реперфузии миокарда in vivo [1]. Вместе с тем остается неясным, в какой степени кардиопротекторный эффект СВ-агонистов связан с активацией миокардиальных каннабиноидных рецепторов, а в какой – является результатом взаимодействия с рецепторами, расположенными экстракардиаль-но. Литературные данные о роли СВ1- и СВ2-рецепторов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии носят противоречивый характер. Одни авторы полагают, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ1-рецепторов [2, 13], а другие исследователи полагают [4, 7, 11], что инфаркт-лимитирующий эффект каннабиноидов определяется стимуляцией СВ2-рецепторов. Ответ на эти вопросы могли бы дать эксперименты in vitro с агонистами каннабиноидных рецепторов.

Цель: выяснить рецепторную природу кардиопротек-торного эффекта каннабиноидов.

Материал и методы

Эксперименты проводились на крысах самцах линии Вистар массой 250–300 г. Сердце, выделенное из грудной клетки, помещали в ванночку со льдом, подвешивали за аорту к канюле установки изолированного сердца и перфузировали раствором Кребса–Хензелайта. Все эксперименты проводили по следующей схеме: 20 мин адаптации + 10 мин перфузии фармакологическим агентом + 10 мин перфузии без фармакологического агента (“отмывка от препарата”) + 45 мин тотальной ишемии + 30 мин реперфузии. Раствор Кребса–Хензелайта готовили на дистиллированной воде, которую подвергали дополнительной очистке на установке “Simplicity” компании Millipore (Millipore, США). В качестве контроля были использованы изолированные сердца, которые перфузировали по следующему протоколу: 20 мин адаптации + 10 мин перфузии с диметилсульфоксидом (DMSO, 0,01%,) + 10 мин “отмывка от DMSO” + 45 мин тотальной ишемии + 30 мин реперфузии. Используемые в эксперименте препараты растворяли в диметилсульфоксиде и добавляли в перфузионный раствор. Конечная концентрация DMSO составляла в растворе 0,01%. В этой концентрации он не влиял на сократимость миокарда и устойчивость сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям [4]. В работе были использованы: агонист СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 ([(6aR)-trans-3-(1,1-Dimethylheptyl)-6a,7,10,10a-tetrahydro-1-hydroxy-6,6-dimethyl-6H-dibenzo [b,d]pyran-9-methanol) в конечных концентрациях 0,1х10–3 и 1,0х10–3 мМ; селективный агонист СВ1-рецеп-торов ACPA (arachidonilcyclopropilamid/N-(cyclopropil)-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenamide) в тех же концентрациях; агонист каннабиноидных рецепторов анандамид (ара-хидонилэтаноламид) – 1 мкМ/л; агонист каннабиноидных рецепторов метанандамид ((R)-N-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenamide) – 1,0х10– 3 мМ; селективный агонист СВ2-рецепторов JWH 133 ((6aR,10aR)-3-(1,1-dimethylbutyl)-6a,7,1010a-tetrahydro-6,6,9-trimethyl-6H-dibenzo[b,d]pyran) – 0,1 мкМ; агонист СВ1- и СВ2-рецепторов СР55.940 ((-)-cis-3-[2-Hydroxy-4-(1,1-dymethylheptyl)phenyl]-trns-4-(hydroxipropyl)cyclohexanol) – 0,1х10–3 и 1,0х10–3 мМ. При выборе концентраций СВ-агонистов мы опирались на ранее опубликованные нами данные о кардиопротектор-ной активности HU-210 [2]. Для изучения роли СВ1- и СВ2-рецепторов в реализации кардиотропных эффектов каннабиноидов использовали селективный антагонист СВ1-рецепторов SR141716 (N-[piperidin-1-yl]-1-[1,2- dichlorophenyl]-4-methyl-1H-pyrazole-3-caboxamid HCl) в конечной концентрации 0,1х10–3 мМ [6] и селективный антагонист СВ2-рецепторов SR144528 (N-(1S)-endo-1,3,3-trimethylbicyclo [2.2.1] hepta-2-yl]-5-(4-chloro-3-methylphenyl)-1-(4-ethylbenzyl)-pyrazole-3-carboxamide) в конечной концентрации 0,1х10–3 мМ [6]. В конце эксперимента в перфузате, собранном за 30 мин реперфузии, определялся уровень креатинфосфокиназы (КФК) с помощью стандартных наборов CK NAC, (Marienhagen, Германия). Активность КФК определяли на спектрофотометре Smart Spec Plus (Bio-Rad, США). Конечный результат выражали в мкмоль НАДН/мин в пересчете на 1 г ткани сердца за 30 мин реперфузии (U/г). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы STATISTICA 6.0 (StatSoft). Для проверки нормальности распределения числовых показателей использовался критерий Колмогорова–Смирнова; для оценки достоверности различий между группами использовался непараметрический критерий Манна–Уитни для количественных признаков. Статистически значимыми считались различия при p<0,05. Результаты всех экспериментов приведены в рисунках, где указан разброс значений относительно средних величин.

Результаты и обсуждение

На первом этапе нашей работы мы исследовали роль эндогенных агонистов каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости миокарда при ишемии-реперфузии. Для этого нами были выполнены две серии экспериментов с использованием селективных блокаторов каннабиноидных рецепторов 1 и 2-го типов: SR141716 и SR144528 в конечной концентрации 0,1х10–3 мМ, что достаточно для полной блокады СВ1- и СВ2-рецепторов соответственно [6]. В контрольной серии после тотальной ишемии изолированного сердца с последующим возобновлением коронарной циркуляции отмечалось развитие некроза кардиомиоцитов. Об этом свидетельствовало повышение активности КФК в 4,5 раза в растворе, оттекающем от сердца, по сравнению с исходными значениями (рис. 1). В случае предварительной блокады СВ1-рецепторов миокарда с помощью SR 141716 или блокады СВ2-рецепторов с помощью SR144528 каких-либо существенных различий в активности креатинфосфокиназы, по сравнению с контролем, в доишемическом и реперфузионном периодах нами отмечено не было. Изменение уровня КФК в оттекающем от сердца растворе оставалось практически идентичным в контрольной и опытной сериях.

Полученные результаты указывают на то, что эндогенные агонисты каннабиноидных рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости сердца неадаптированных крыс к действию ишемии и реперфузии. К сказанному следует добавить, что сходные данные были получены нами ранее в экспериментах in vivo , в ходе выполнения которых было установлено, что предварительное внутривенное введение селективного блокатора СВ1-рецепторов SR141716 или блокатора СВ2-рецепто-ров SR144528 не влияет на размер зоны инфаркта при коронароокклюзии и реперфузии [2].

Исходные значения до ишемии

Во время реперфузии

Рис. 1. Уровень КФК в перфузате до ишемии и во время реперфузии в сериях с применением блокатора СВ1-рецепторов SR141716 и блокатора СВ2-рецепторов SR144528 в конечной концентрации 0,1х10–3 мМ

Рис. 2. Сравнительный анализ кардиопротекторного эффекта агонистов каннабиноидных рецепторов (значения креатинфосфокиназы, собранные за 30 мин реперфузии). * – p<0,05 по сравнению с контролем. Контроль – ишемия и реперфузия

чения концентрации, по-видимому, связано с неспецифическим действием препарата, то есть c активацией пока не идентифицированных неканнабиноидных рецепторов, стимуляция которых негативно сказывается на устойчивости сердца к ишемии-реперфузии.

Наши дальнейшие исследования были продолжены в направлении изучения кардиопротекторных свойств эффектов селективных агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов. Применение селективного агониста

СВ1-рецепторов АСРА в концентрации 0,1х10–3 мМ не приводило к достоверным изменениям активности КФК в перфузионном растворе, как до ишемии, так и в периоде реперфузии (рис. 2). Однако в большей концентрации (1,0х10–3 мМ) препарат оказывал достоверный кардио-протекторный эффект. В этом случае уровень КФК в перфузате был в 1,75 раза меньше, чем в контроле (рис. 2). Полученные данные дали основания полагать, что кардиопро-текторный эффект селективного агониста СВ1-рецепторов ACPA связан с активацией каннабиноидных рецепторов первого типа. При этом эффект препарата был дозозависимым, поскольку в меньшей дозировке ACPA не оказывал кардиопротек-торного действия, а антинекроти-ческий эффект этого СВ1-агониста отмечался только при использова-

На втором этапе работы мы исследовали влияние агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов на устойчивость миокарда к действию ишемии и реперфузии: HU-210, ACPA, JWH133, анандамид, метанандамид, CP55.940. В результате оказалось, что наиболее выраженный кардиопротек-торный эффект проявлял агонист каннабиноидных рецепторов HU-210 в концентрациях 0,1х10–3 и 1,0х10–3 мМ, поскольку снижение реперфузионного выброса КФК при его применении составило в среднем 43% по отношению к аналогичным величинам в контроле (рис. 2). В серии с применением СР55.940 в концентрации 0,110–3 мМ активность креатинкиназы в перфузате во время реперфузии была в 2,2 раза ниже, чем в контроле (рис. 2). Однако использование СР55.940 в большей концентрации (1,0х10–3 мМ) не привело к ожидаемому усилению кар-диопротекторного эффекта, поскольку статистически значимого снижения активности КФК в перфузате во время реперфузии по сравнению с контролем мы не зарегистрировали (рис. 2). Таким образом, агонист СВ1- и СВ2-рецепторов СР 55.940 оказывает кардиопротекторное действие лишь в дозировке 0,1х10–3 мМ. Исчезновение кардиопротекторного эффекта CP55.940 по мере увели- нии препарата в концентрации 1,0х10–3 мМ. Однако в этом случае нельзя было исключить вероятность того, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ2-рецепторов, поскольку Ki (константа ингибирования) к СВ2-рецепторам у этого агониста составляет 715 нМ. В связи с этим мы провели эксперименты с агонистом СВ2-рецепторов JWH133. Оказалось, что перфузия изолированного сердца раствором Кребса–Хензелайта, содержащим агонист СВ2-рецепторов JWH 133 (0,1х10–3 мМ), практически не повлияла на реперфузионный выброс КФК. Следовательно, исследуемый агонист СВ2-рецепторов не проявил кардиопротекторных свойств на модели тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца. Этот факт может свидетельствовать в пользу того, что кардиопро-текторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ1-рецепторов, расположенных в миокарде.

Исследование роли каннабиноидов в формировании устойчивости миокарда к действию ишемии и реперфузии мы продолжили с применением агонистов каннабиноидных рецепторов анандамида и его энзимоустойчивого аналога метанандамида. Исследуемые препараты не влияли на уровень креатинфосфокиназы в реперфузи-

МКМ/Г X мин

Рис. 3. Уровень КФК в перфузате до ишемии и во время реперфузии в сериях с применением агониста СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210 (0,1х10–3 мМ), антагониста СВ1-ре-цепторов SR141716 (0,1 мкМ), антагониста СВ2-рецепторов SR141716 (0,1х10–3 мМ).

* – p<0,05 по сравнению с контролем. Контроль – ишемия и реперфузия

онном периоде. Данный факт мог быть связан со значительно меньшим сродством анандамида и метанандами-да к каннабиноидным рецепторам, чем у рассмотренных выше синтетических агонистов СВ-рецепторов [15]. Кроме того, отсутствие кардиопротекторного эффекта у этих препаратов в используемых нами концентрациях могло быть связано с тем, что анандамид и метанандамид подверглись энзиматическому гидролизу в ткани миокарда и в результате не оказали влияния на толерантность кардиомиоцитов к действию ишемии и реперфузии. Более высокие концентрации анандамида и его аналога мы не использовали, потому что в высоких концентрациях они могут активировать ваниллоидные или анандамидовые рецепторы, к которым они проявляют умеренное сродство [16].

Следующим этапом нашей работы было выяснение роли СВ1- и СВ2-рецепторов в реализации кардиопро-текторного эффекта HU-210. С этой целью были проведены серии экспериментов с применением селективных блокаторов СВ1- и СВ2-рецепторов: SR141716 и SR144528.

Оказалось, что кардиопротекторный эффект каннабиноида HU-210 не проявляется в случае предварительной блокады СВ1-рецепторов с помощью SR141716 (рис. 3). Как показано на рисунке 3, после перфузии изолированных сердец раствором, содержащим SR141716 (0,1х10–3 мМ) и HU-210 (0,1х10–3 мМ), реперфузионный выброс креатинкиназы практически не отличался от соответствующих значений контрольной серии. В то же время применение блокатора СВ2-рецепторов SR144528 не приводило к устранению кардиопротекторного эффекта HU-210. При этом сами антагонисты никак не повлияли на уровень КФК в перфузате (рис. 1).

Выяснение рецепторной природы кардиопротектор-ного эффекта HU-210 позволило заключить, что он реализуется посредством активации СВ1-рецепторов.

Заключение

Результаты выполненных экспериментов с антагонистами СВ1-и СВ2-рецепторов свидетельствуют о том, что эндогенные каннабиноиды не участвуют в регуляции устойчивости миокарда к ишемическим и реперфузионным воздействиям. Экзогенно вводимые синтетические каннабиноиды по способности повышать устойчивость сердца к ишемическим воздействиям и реперфузии располагаются следующим образом: HU-210>СР55.940>ACPA. При этом эти каннабиноиды имеют различное химическое строение и принадлежат к разным классам, что не мешает им проявлять кардиопро-текторные свойства. Выраженность кардиопротекторного эффекта использованных нами каннабиноидов не зависит от их хи- мического строения, а определяется сродством к СВ1-ре-цепторам. Цитопротекторный эффект каннабиноида HU-210 связан с активацией СВ1-рецепторов.

Работа подготовлена при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям, государственный контракт № 02.740.11.0714, контракт №11.519.11.2016, № 11.519.11.2028, РФФИ гранты: 10-04-00288, 11-04-00467, 11-04-98001, 11-04-98000, 11-04-98004.