Редокс-статус эритроцитов периферической крови при экспериментальном раке яичников на фонеаутогемохимиотерапии цисплатином и доксорубицином

Введение. Окислительный стресс в настоящее время рассматривается как универсальный неспецифический механизм инициации опухолевого роста [1, 2]. При этом свободнорадикальные реакции играют ключевую роль не только в процессе первичной малигни-зации, но и в прогрессировании неоплазмы [3].

Установлено, что на ранних этапах развития злокачественная опухоль оказывает существенное влияние на эритрон. В циркулирующих эритроцитах, в частности, снижается концентрация свободных радикалов. Результатом воздействия неоплазмы является изменение морфофункциональных свойств эритроцитов. Установлено, что средняя продолжительность жизни эритроцитов у пациентов со злокачественными опухолями снижается в 1,5–2 раза. Возникающая при этом анемия является одним из частых осложнений. По данным регистрационных исследований ECAS, в странах Евросоюза анемия (содержание гемоглобина менее 120 г/л) имела место у 39 % онкологических больных [4]. И если анемия не констатировалась на момент постановки диагноза, то с вероятностью 62 % она развивалась в процессе лечения. Анемия и возникающая при этом тканевая гипоксия снижают эффективность лечения рака. Изменяется биология опухоли. В частности, через активацию генов семейства HIF усиливается продукция VEGF, отвечающего за ангиогенез в опухоли и способствующего её росту и метастазированию. Анализ данных об оценке влияния анемии на выживаемость показал, что медиана ежегодного риска смерти онкологических больных с анемией на 65 % выше, чем больных без анемии [5].

Ранняя диагностика рака яичников (РЯ) представляет актуальную проблему современной онкогинекологии [6]. Доказано, что активация свободнорадикального окисления, усиливающаяся при нарастании опухолевой массы, лежит в основе патогенеза РЯ [7, 8]. Злокачественные опухоли яичников чувствительны к проведению лекарственной полихимиотерапии (ПХТ). Однако у пациенток с РЯ III–IV стадий возможности ПХТ, обладающей выраженным токсическим воздействием, ограничены в связи с уже имеющимися нарушениями метаболических функций в результате нарастания опухолевой массы в организме [9]. Использование аутогемохимиотерапии (АГХТ), по мнению авторов метода, значимо снижает токсические эффекты лечения [10]. Однако в доступной литературе отсутствуют данные о влиянии АГХТ на морфофункциональное состояние эритроцитов циркулирующей крови, нарушение которого приводит к анемии.

Цель исследования. Оценка редокс-статуса эритроцитов периферической крови при экспериментальном раке яичников на фоне АГХТ цисплатином и доксорубицином.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования были проведены на 144 белых беспородных крысах массой 180– 200 г. Модель рака яичников воспроизводили путем перевивки опухолевого штамма асцитной опухоли яичника (АОЯ) (НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва). После предварительного пассажа на 8-й день после внутрибрюшинной перевивки от одной крысы был взят асцит и перевит животным экспериментальной группы в объеме 0,5 мл 9-дневного инокулята (асцитическая жидкость с 7×10 ⁷ опухолевых клеток) и 0,5 мл питательной среды 199 на 100 г массы животного [11]. Все животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. Были соблюдены правила гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР от 12.08.1977 № 755, положениями Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг., а также требованиями этического комитета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета. Животных умерщвляли путем декапитации под эфирным наркозом. В исследованиях использованы доксорубицин (ДОК) («Эбеве», Австрия) и цисплатин (ЦП) («ЛЭНС-Фарм», Россия), в качестве антикоагулянта – гепарин.

Дозу для введения цитостатиков рассчитывали по номограмме на квадратный метр поверхности тела животного [12]: для доксорубицина – 40 мг/м ² , для цисплатина – 75 мг/м ² . АГХТ осуществляли путем реинфузии крови (1,0 мл), проинкубированной в термостате в течение 45 мин при 37 °С с гемоконсервантом и химиопрепаратом, в яремную вену животным. ПХТ проводили путем введения в яремную вену химиопрепаратов, растворенных в физиологическом растворе. Кровь для исследования редокс-статуса периферических эритроцитов забирали через 3 и 8 дней после ПХТ и АГХТ.

Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах оценивали по уровню диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов (КД), шиффовых оснований (ШО) по интенсивности поглощения при длинах волн соответственно 232, 278 и 400 нм в гептановом экстракте по методу И.А. Волчегорского [12]. Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли в тесте с тиобарбитуровой кислотой [13]. Содержание продуктов окислительной модификации белков (ОМБ) оценивали при 346, 370, 430, 530 нм по методу R.L. Levin (1990) в модификации Е.Е. Дубининой [14]. Активность антиоксидантных ферментов (АОФ), а именно супероксид-дисмутазы (СОД), оценивали по способности конкурировать с нитросиним тетразолием за супероксид-анион по методу M. Nishikimi; активность каталазы – по скорости утилизации Н 2 О 2 ; активность глутатион-трансферазы (ГТ) – по скорости ферментативного образования GS-2,4-динитробензола в катализируемой ферментом реакции восстановления глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом [15].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни (Stata 6.0) и стандартных пакетов Microsoft Excel (2007). Различия считали статистически значимыми при p≤0,05.

Результаты и обсуждение. Полученные результаты представлены в табл. 1.

В результате проведенных исследований установлено значимое повышение на всех изучаемых стадиях уровня продуктов перекисного окисления липидов (ДК, КД, ШО, МДА) в эритроцитах крыс с АОЯ по сравнению с интактными. Одновременное значимое и выраженное снижение активности антиоксидантных ферментов (ГТ, каталазы и СОД) может свидетельствовать о возможности возникновения в эритроцитах крыс с АОЯ оксидативного стресса. На развитие в этих эритроцитах карбонильного стресса указывает значимое возрастание альдегидных (λ=346 нм) и кетонных (370 нм) групп нейтрального характера и кар- бонильных производных основного характера (430 и 530 нм).

Введение ДОК и ЦП методом АГХТ однонаправленно и значимо снижало уровни всех продуктов ПОЛ. При ПХТ на фоне введения ДОК и ЦП изменение уровней продуктов ПОЛ было разнонаправленным: уровень МДА снижался, уровни ДК и КД (при введении ЦП) возрастали; уровень ШО снижался на фоне введения ДОК и не изменялся на фоне введения ЦП.

В то же время на фоне АГХТ и ПХТ с использованием ДОК и ЦП однонаправленно и значимо возрастала активность антиоксидантных ферментов (каталазы и СОД). Активность ГТ возрастала только при использовании АГХТ. Введение ДОК традиционным способом значимо снижало активность ГТ, а на фоне введения ЦП активность ГТ не изменялась.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о нивелировании явлений оксидативного стресса на фоне АГХТ с использованием ДОК и ЦП в эритроцитах организма-опухоленосителя. Анализ параметров ОМБ показал снижение уровня продуктов всех четырех групп на фоне ПХТ по сравнению с уровнем до введения химиопрепаратов. На фоне АГХТ произошло снижение альдегидных и кетонных групп нейтрального характера. Уровень альдегидных и кетонных групп основного характера в эритроцитах крыс с АОЯ на фоне АГХТ возрос по сравнению с уровнем до введения.

Сравнительный анализ изученных параметров на фоне ПХТ и АГХТ показал, что все исследуемые показатели значимо различаются для обоих препаратов в зависимости от способа введения. При этом при АГХТ более выражено снижение параметров ПОЛ и повышение ГТ, но одновременно имеет место возрастание уровней некоторых продуктов ОМБ.

Заключение. АГХТ с использованием ЦП и ДОК при экспериментальном РЯ нивелирует явления оксидативного стресса в эритроцитах организма-опухоленосителя.

Таблица 1

Примечание. Значимые изменения по сравнению со значениями: * - в контроле (непараметрическая статистика, # - до введения цитостатиков АГХТ; • - на фоне ПХТ.