Регенерация меристем и рост черенков Solanum tuberosum L. при клональном микроразмножении in vitro под действием электростатического поля

Известно, что атмосферное электричество оказывает положительное влияние на онтогенез, рост осевых органов растений, ускоряет прохождение процессов растяжения и дифференцировки растительных клеток и т.д. (1, 2). Отсутствие естественного электрического поля задерживает физиологические процессы, направленные на создание органического вещества: наблюдается снижение интенсивности фотосинтеза и дыхания, нарушается минеральный обмен (3-5). Положительный эффект внешнего электрического поля выявлен у многих видов сельскохозяйственных культур (1, 6, 7).

Первые работы по электростимуляции растительных объектов в культуре in vitro относятся к середине 80-х годов прошлого столетия. Так, под влиянием электрического тока силой 13 мкА рост побегов табака усиливался в 5 раз по сравнению с контролем (8). В культуре протопластов мезофилла листьев люцерны слабое электрическое поле стимулировало соматический эмбриогенез (9). При пропускании в течение 2 нед постоянного тока силой 2 мкА через иноку-люмы каллусов кукурузы усиливался рост последних, а также ризогенез и соматический эмбриогенез (10). У плодовых и ягодных растений в культуре in vitro под влиянием электростатического поля увеличивались приживаемость апексов, линейный рост регенерантов, а у черной смородины коэффициент размножения возрастал в 1,3 раза (6).

Представляет интерес анализ взаимодействия внешнего электрического поля и растения: ответные реакции растительного организма, физиолого-биохимические механизмы эффекта электростимуляции растений в зависимости от напряженности электрического поля и генотипа объекта и др.

В задачу нашей работы входило определение оптимальных режимов воздействия электростатического поля на регенерацию меристем, образование и развитие черенков растений картофеля разных сортов в культуре in vitro с целью повышения коэффициента размножения.

Методика. Объектом исследований служили следующие сорта картофеля: Удача, Голубизна, Луговской, Резерв, Ильинский (ВНИИ картофельного хозяйства); Романо, Санте, Конкорд (Голландия), рекомендованные для промышленного производства на территории России; Хонгор, Сэлэнгэ, Шийр-6 (Монголия). Апикальные меристемы изолировали из предварительно стерилизованных в 0,1 % растворе диацида этиолированных проростков под бинокулярной лупой МБС-2. Размер экспланта (250 ± 50 мкм) определяли с помощью окуляр-микрометра. Изолированные меристемы помещали в пробирки на среду Мурасиге-Скуга с добавлением витаминов (по Бутенко), сахарозы (20 г/л ) и агар-агара (8 г/л). Регенерацию меристем индуцировали посредством добавления гибберелловой кислоты и кинетина в концентрации соответственно 2 и 1 мг/л. Для микрочеренкования использовали пробирочные растения с 8-10 листочками. При культивировании черенков in vitro индуктором корнеобразования служила в —индолилмасляная кислота в концентрации 0,1 мг/л. Эти методы разработаны во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной биотехнологии и рекомендованы для производства безвирусного семенного картофеля (11).

Как апикальные меристемы, так и микрочеренки культивировали в камерах фитотрона при следующих условиях: температура воздуха 22 ± 2 ^оС, освещенность на уровне растений 5 клк, продолжительность светового дня 16 ч. Электростатическое поле создавали генератором высокого напряжения В-524. Один полюс генератора соединяли с токопроводящей пластиной, на которой устанавливали штативы с пробирками, другой — с металлической сеткой, снабженной ячейкой 2 x 2 мм и расположенной на высоте 25-30 см от нижней пла-73

стины*. Зависимость напряженности электростатического поля ( Е ) между пластинами от подаваемого напряжения ( U ) и расстояния ( l ) между последними определяли по формуле U

E =   . Воздействие электростатического поля было постоянным на протяжении всего пассажа (20-30 сут). На отдельных этапах эксперимента меняли напряженность и полярность электростатических полей. По каждому варианту анализировали от 15 до 20 растений. Перед закладкой основных опытов мы провели предварительный эксперимент, позволивший определить диапазон эффективной напряженности электростатического поля — 5-30 кВ/м.

Биоэлектрические потенциалы (БЭП) растений картофеля регистрировали с помощью неполяризующихся хлорсеребряных электродов ЭВЛ-1МЗ и цифрового рН-метра 5170 (Польша). При этом измерительный электрод контактировал с поверхностью листа апикальной мутовки через ватный фитилек, смоченный водопроводной водой; электрод сравнения через переходную насадку контактировал с питательной средой, где находились корни растения. Для избежания механического воздействия на ткани контакт осуществляли при помощи специального манипулятора с микрометрическим механизмом, причем регистрацию градиента БЭП проводили после 6-часовой адаптации растений. Для оценки динамики СО2-газообмена использовали прозрачную герметичную камеру, соединенную по «замкнутому» контуру с ИК-газо-анализатором ГОА-4а (концентрация СО2 составляла 0-0,05 %).

Статистическую обработку данных проводили по Доспехову (12).

Результаты. Прижившимися считали экспланты, имеющие зеленую окраску, которые после ряда пересадок на свежие культуральные среды регенерировали. В предварительном опыте изучали влияние электростатического поля на приживаемость меристемы и выход регенерантов картофеля сортов Удача, Голубизна и Луговской при напряженности +10 и –10 кВ/м (табл. 1). Общий выход регенерировавших меристем в среднем по трем сортам при E = +10 кВ/м составлял 121,5 % от контроля, у сортов Голубизна и Луговской — соответственно 126,4 и 151,5 %.

1. Приживаемость меристем и выход регенерантов различных сортов картофеля in vitro под действием электростатического поля разной полярности

Сорт	Напряженность электростатического поля, кВ/м	Приживаемость меристем		Выход регенерантов
		%	по отношению к контролю, %	%	по отношению к контролю, %
Удача	+10	93,5	107,0	54,8	86,7
	–10	93,3	107,5	67,4	106,6
	0 (контроль)	86,8	–	63,2	–
Голубизна	+10	80,0	106,7	47,4	126,4
	–10	81,7	108,9	30,0	80,0
	0 (контроль)	75,0	–	37,5	–
Луговской	+10	100,0	111,1	83,3	151,5
	–10	92,8	103,1	53,7	97,7
	0 (контроль)	90,0	–	55,0	–
Среднее	+10	91,2	108,2	61,8	121,5
	–10	89,3	108,8	50,4	94,8
	0 (контроль)	83,9	–	51,9	–

* Установка создана на кафедре физиологии растений Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева при участии Н.А. Голика и О.С. Фанталова.

В следующем опыте использовали меристемы сортов картофеля Ильинский, Сэ-лэнгэ и Хонгор. В течение 20 и 30 сут (соответственно I и II варианты) культуры in vitro подвергали воздействию электростатических полей, напряженность которых составляла 5, 10 (контроль) и 15 кВ/м (табл. 2). В I варианте опыта при Е = 15 кВ/м приживаемость меристем и регенерация в среднем были на 8,2 и 12,0 % выше, чем в контроле ( Е = 10 кВ/м). Во II варианте опыта приживаемость меристем и выход регенерантов уменьшались.

• 2.    Приживаемость меристем и выход регенерантов различных сортов картофеля в зависимости от напряженности и продолжительности действия электростатического поля

  Сорт	Приживаемость меристем, %          Выход регенерантов, % I вариант    1    II вариант        I вариант   1      II вариант

Е = 5 кВ/м

Ильинский	86,7	92,9	66,7	85,7
Сэлэнгэ	85,7	80,0	57,1	66,7
Хонгор	93,3	100,0	93,3	93,3
Среднее	88,6	91,0	72,4	81,9
		Е = 10 кВ/м
Ильинский	86,7	86,7	66,7	73,3
Сэлэнгэ	73,3	86,7	60,0	53,3
Хонгор	86,7	100,0	86,7	80,0
Среднее	82,2	91,1	77,1	68,9
		Е = 15 кВ/м
Ильинский	86,7	93,3	80,0	73,3
Сэлэнгэ	84,6	80,0	69,2	66,7
Хонгор	100,0	100,0	100,0	78,7
Среднее	90,4	91,1	83,1	72,9

П р и м е ч а н и е. I и II вариант — продолжительность воздействия электростатического поля в течение соответственно 20 и 30 сут; Е — напряженность поля.

Оценку регенерации растений из микрочеренков проводили на сортах картофеля Конкорд, Резерв, Шийр-6, Сэлэнгэ и Хонгор. Черенки in vitro подвергали в течение 30 сут воздействию электростатического поля при напряженности –10 и +10 кВ/м; в контроле Е = 0 (табл. 3, рис.). Увеличение длины надземной части растений и корней первого порядка в среднем по трем сортам при Е = –10 кВ/м оказалось соответственно на 8,9 и 25,5 % выше, чем в контроле. Градиент БЭП при этом увеличился на 10 мВ.

При Е = +10 кВ/м отмечен значительный прирост фотосинтезирующей части растений — на 22,8 % больше, чем в контроле. В то же время рост корней существенно замедлялся: общая длина корней первого порядка составляла лишь 70,2 % от контроля. В этом варианте опыта у растений наблюдалось образование большего числа междоузлий и

Длина стеблей (1) и корней (2) микропобегов картофеля in vitro под влиянием электростатического поля разной полярности.

увеличение накопления сухой массы (см. табл. 3). Аналогичные данные были получены в работах других авторов (5).

При действии электростатического поля отмечено некоторое снижение дыхательной активности пробирочных растений во всех вышеописанных вариантах опыта (см. табл. 3).

В следующем опыте стимулирование роста микрочеренков растений картофеля трех сортов (Санте, Конкорд и Резерв) проводили при напряженности электростатического поля 10, 20 и 30 кВ/м (табл. 4). Стимулирующий эффект возрастал при постепенном увеличении напряженности поля. Растения сорта Конкорд из этого варианта опыта мы использовали для полевой оценки.

• 3.    Оценка развития in vitro растений из микрочеренков картофеля различных сортов под действием электростатического поля разной полярности

• 4.    Оценка регенерации и развития растений из микрочеренков картофеля различных сортов под действием электростатического поля разной напряженности

Сорт	Длина побега, см	Число пазушных почек	Сухая масса расте-ний, г	Общая длина корней первого порядка, см	Градиент БЭП, мВ	Газообмен, мл СО 2 /ч на одно растение
			Е = –10 кВ/м
Конкорд	9,4	9,3	0,026	126,8	–66,1	0,28
Резерв	5,8	8,2	0,015	53,9	–57,8	0,19
Шийр-6	8,6	9,0	0,034	147,6	–65,6	0,49
Хонгор	9,8	9,8	0,026	236,3	–68,2	0,26
Сэлэнгэ	9,3	9,7	0,031	140,0	–81,0	0,30
Среднее	8,6	9,2	0,026	140,9	–67,7	0,30
% к контролю	108,2	102,2	101,5	125,5	126,5	83,3
			Е = +10 кВ/м
Конкорд	8,7	8,5	0,023	50,6	–73,2	0,17
Резерв	9,7	11,2	0,032	75,3	–56,9	0,30
Шийр-6	8,8	9,6	0,040	82,6	–32,8	0,34
Хонгор	10,6	10,0	0,040	102,8	–68,1	0,27
Сэлэнгэ	10,8	10,7	0,042	82,7	–66,7	0,53
Среднее	9,7	10,0	0,035	78,8	–59,5	0,32
% к контролю	122,1	111,1	136,2	70,2	111,2	88,9

Е = 0 (контроль)

Конкорд	6,5	7,7	0,013	31,3	–34,6	0,21
Резерв	6,4	9,2	0,019	101,4	–53,8	0,27
Шийр-6	7,3	9,0	0,031	152,0	–56,7	0,34
Хонгор	9,5	8,8	0,029	119,2	–71,3	0,30
Сэлэнгэ	9,9	10,3	0,038	157,5	–51,0	0,70
Среднее	7,9	9,0	0,026	112,8	–53,5	0,36

П р и м е ч а н и е. БЭП — биоэлектрический потенциал.

Поскольку при доращивании на гидропонной установке растения картофеля значительно лучше переносят адаптацию к условиям in vivo, пробирочные растения пересаживали на гидропонную среду следующего состава: гидроудобрение «Кемира» (15 г), Ca(NO 3 ) 2 (10 г), pH 6,5; замену раствора производили через 6 сут. Через 2 нед растения пересаживали в полевые условия, при этом количество прижившихся особей составило 68 %. При Е = 20 кВ/м число стеблевых побегов, миниклубней, общая масса последних и сырая масса ботвы соответственно на 13,4; 13,8; 19,4 и 26,1 % были выше, чем в контроле. При Е = = 10 кВ/м масса миниклубней, диаметр и число глазков, приходящихся на один миниклубень, были больше, чем в контроле, соответственно на 55,4; 20,0 и 8,5 %. По всем вариантам получены нормально развитые растения.

Сорт	Длина побега, см	Число пазушных почек	Сырая масса растений, г	Число корней первого порядка	Длина корней первого порядка, см		Градиент БЭП, мВ	Газообмен, мл СО 2 /ч на одно растение
					общая	средняя		фотосинтетический	дыхательный
Санте	9,0	9,7	0,36	Е = 10 кВ/м 17,5      79,7		4,4	–19,1	0,29	0,16
Конкорд	10,0	9,8	0,29	10,7	45,3	4,5	–26,5	0,20	0,18
Резерв	10,7	12,4	0,41	20,5	107,8	4,8	–27,8	0,20	0,26
Среднее	9,9	10,6	0,35	16,2	77,6	4,6	–24,5	0,23	0,20
Санте	8,8	10,4	0,26	Е = 20 кВ/м 13,7      50,9		3,6	–22,2	0,14	0,20
Конкорд	10,3	9,9	0,35	12,6	55,7	4,4	–33,4	0,13	0,19
Резерв	11,3	12,8	0,35	14,0	61,4	4,0	–27,2	0,19	0,27
Среднее	10,1	11,0	0,32	13,4	56,0	4,0	–27,6	0,15	0,22
Санте	9,95	11,2	0,39	Е = 30 кВ/м 16,5      90,0		5,6	–29,1	0,23	0,21
Конкорд	9,7	9,8	0,34	11,5	62,9	5,5	–30,2	0,17	0,21
Резерв	12,5	14,3	0,46	27,9	138,5	4,8	–40,2	0,28	0,35
Среднее	10,7	11,8	0,40	18,6	97,1	5,3	–33,2	0,23	0,26

П р и м е ч а н и е. Приведены показатели на одно пробирочное растение. БЭП — биоэлектрический потенциал.

Таким образом, оптимальная напряженность электростатического поля, при которой наблюдались наибольшая приживаемость и высокая регенерационная способность меристем картофеля различных сортов, составляла 10 кВ/м. На этапе черенкования отмечены сортовые различия по реакции на воздействие электростатического поля, которые необходимо учитывать в последующих экспериментах. При действии электростатического поля на разных этапах клонального микроразмножения растений картофеля увеличиваются градиенты биоэлектрической полярности, которые отражают работу мембранза-висимых систем, активность ферментов, интенсивность транспорта ассимилятов, распределение воды и другие метаболические процессы (13). Полевые испытания подтвердили положительный эффект воздействия электростатического поля на количественные признаки и продуктивность растений сорта Конкорд, полученных из меристем. В связи с этим мы полагаем, что электростимуляцию можно применять для регенерации в культуре ткани растений, которые трудно переходят к органогенезу, а также для повышения частоты выхода регенерантов в сомаклонах и культурах, полученных на основе генной инженерии, где необходима ускоренная регенерация с целью предотвращения нежелательной генетической изменчивости.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    М е д в е д е в С.С. Электрические поля и рост растений. В сб.: Электронная обработка материалов. Кишинев, 1990, 3: 68-74.

• 2.    Ш о г е н о в Ю.Х. Управление адаптацией растения низкоэнергетическими электрическими потенциалами. Автореф. докт. дис. М., 1999.

• 3.    Ж у р б и ц к и й З.И. Электричество атмосферы и вопросы питания растений. Агрохимия, 1972, 3:

• 4.    Ж у р б и ц к и й З.И. Влияние постоянного электрического поля на адсорбцию СО 2 листьями растений. Докл. АН СССР, 1975, 223, 5: 1273-1275.

• 5.   М е д в е д е в С.С. Физиологические основы полярности растений. СПб, 1996.

• 6.   Д е м е н к о В.И., К а м е н с к а я К.И., Т р е т ь я к о в Н.Н. Влияние электростатического поля на

  рост и развитие плодовых и ягодных растений in vitro. Докл. ТСХА, 1995, 226а: 107-110.

• 7.    П а н ф и л о в а О.Ф., А д р и а н о в В.Н. Электростимуляция укоренения зеленых черенков хризантемы после длительного хранения. Изв. ТСХА, 1996, 1: 105-113.

• 8.    G o l d s w o r t h y A., R a t h o r e K.S. The electrical control of growth in plant tissue cultures: the polar transport of auxin. J. Exp. Bot., 1985, 36, 86: 1134-1141.

• 9.    D i j a k M., S m i t h D.L., W i l s o n T.J. e.a. Stimulation of direct embryogenesis from mesophyll protoplasts of Medicago sativa . Plant Cell Rep., 1986, 5, 6: 468-470.

• 10.    К и т л а е в Г.Б., Д и а с С., В е р а - Р а м о с Т.Ю. и др. Стимуляция слабым электрическим током регенерации растений в культуре тканей кукурузы. Биотехнология, 2001, 5: 58-63.

• 11.    М е л и к - С а р к и с о в О.С., О в ч и н н и к о в а В.Н., У л ь я н о в Р.П. Получение безвирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре in vitro (метод. реком.). М., 1985.

• 12.  Д о с п е х о в Б.А. Методика полевого опыта. М., 1973.

• 13.  О п р и т о в В.А. Функциональные аспекты биоэлектрогенеза у высших растений. Нижний Новго

  род, 1998.

95-106.

Московская сельскохозяйственная академия                  Поступила в редакцию 15

им. К.А. Тимирязева, 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49;                мая 2003 года

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Москва

MERISTEM REGENERATION AND GROWTH OF CUTTING OF Solanum tuberosum L.

DURING CLONAL MICROCULTIVATION IN VITRO UNDER THE INFLUENCE OF

ELECTROSTATIC FIELD

Ch. Suvd, V.N. Ovchinnikova, L.A. Panichkin, E.N. Akanov, N.N. Tret’yakov, O.S. Melik-Sarkisov

S u m m a r y

The authors investigated the action of electrostatic field of various tencity on morphogenesis of potato plants in culture in vitro at the different stages of clonal microcultivation. The varieties differences were estimated by plants’ reaction on effect of electrostatic field. It was shown that the field tencity of 10 kV/m is optimal for meristem regeneration. On the cutting stage the varieties differences in their reaction on effect of electrostatic field were marked.