Регрессионный анализ зависимости концентрации молекул-индукторов внутреннего пути апоптоза, окислительного стресса и показателей клеточного дыхания в ткани гиппокампа крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) — нейродегенера-тивное заболевание, представляющее собой одну из самых распространённых форм деменции. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, БА является седьмой по частоте причиной смертности населения, при этом важным эпидемиологическим фактором БА признаётся «омоложение» заболевания [1]. В связи с этим активно ведутся исследования, направленные на разработку новых и модификацию уже имеющихся стратегий терапии БА [2]. Следует отметить, что на сегодняшний день всё более пристальное внимание уделяется возможности коррекции митохондриальной дисфункции, что отражено в «митохондриальной» концепции развития и лечения БА [3].

Нарушение структуры и функциональной активности митохондрий, прежде всего, ассоциируют с возникновением энергодефицита и повышением генерации активных форм кислорода, в результате чего активируется внутренний (митохондриальный) путь апоптоза, приводящий в конечном счёте к гибели клетки и усилению нейроденеге-ративного процесса. Внутренний путь апоптоза связан с высвобождением из повреждённых митохондрий в цитозоль клетки трёх основных молекул-индукторов апоптоза: белка гомолога DIABLO (SMAC/DIABLO — второй митохондриальный активатор каспаз), апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ) и цитохрома С [4]. Непосредственным эффектором для SMAC/DIABLO является каспаза-3, активность которой повышается за счёт блокады белков-ингибиторов апоптоза. Высокая концентрация цитохрома С также приводит к активации каспазы-3, через путь «полимеризация APAF-1 → образование апоптосомы → активация каспазы-9». АИФ — белок, не обладающий каталитической активностью, но повышение его концентрации в клетке ведёт к активации неспецифических эндонуклеаз (в частности, эндонуклеазы G), которые напрямую расщепляют ДНК [5]. Несмотря на очевидную взаимосвязь апоптоза, энергодефицита и окислительного стресса, остаётся спорным вопрос о первичном митохондриальном повреждении, которое инициирует выброс проапопто-тических молекул [6].

Кроме того, в настоящее время установлена взаимосвязь между развитием митохондриальной дисфункции и образованием β -амилоида (А β ). В работе Huang et al. (2020) продемонстрировано, что накопление в клетке А β ведёт к нарушению энергетического метаболизма, опосредуемого митохондриями клетки. Так, значительно уменьшается образование НАДН и ФАДН₂, снижается синтез АТФ, увеличивается способность митохондрий к генерации активных форм кислорода, подавляются процессы митофагии [7]. Также Chen et al. показали, что А β может накапливаться в митохондриальном матриксе и вызывать необратимое повреждение митохондрий, что связывают с нарушением активности комплексов III и IV [8]. Указанные свойства А β успешно используются в процессе моделирования БА на лабораторных животных [9].

Цель исследования. Установить взаимосвязь между концентрацией митохондриальных про-апоптотических молекул, окислительным стрессом и показателями активности клеточного дыхания в ткани гиппокампа крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 48 половозрелых крысах Wistar обоего пола (24 самца и 24 самки) массой тела 210–230 г, четырехмесячного возраста, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Россия). Оперативные манипуляции выполнены под хлоралгидратной анестезией (внутрибрюшинное введение хлоралгидрата (PanReac Applichem, Испания) в дозе 350 мг/кг). Концепция работы была одобрена Локальным этическим комитетом ПМФИ (протокол № 8 от 07.07.2023), соответствовала положениям Директивы ЕС 2010/63 и принципам ARRIVE 2.0. Животных разделяли на две равные группы: ЛО — ложнооперирован-ные животные (12 самцов, 12 самок) и БА — группа крыс с воспроизведённой БА (12 самцов, 12 самок). БА спорадического фенотипа моделировали у крыс путём введения агрегатов β -амилоида 1–42 (А β _1–42) в конечной концентрации 1 ммоль/л в СА1 фрагмент гиппокампа (стереотаксические координаты согласно Paxinos G.: переднезадняя —

Таблица 1 / Table 1 Концентрация биомаркеров внутреннего пути апоптоза, окислительного стресса и показатели клеточного дыхания в ткани гиппокампа крыс с экспериментальной болезнью Альцгеймера, Me (Q1-Q3) / Concentration of biomarkers of the intrinsic apoptosis pathway, oxidative stress, and cellular respiration indicators in the hippocampal tissue of rats with experimental Alzheimer’s disease, Me (Q1-Q3)

Группа / Group	SMAC/ DIABLO, пг/ мл / pg/ml	АИФ, нг/мл / AIF, ng/ml	Цитохром С, нг/мл / Cytochrome c, ng/ml	Mito H2O2, мкмоль/л / µmol/l	Аэробное дыхание, ppm/г белка/мин / Aerobic respiration, ppm/g protein/min	Анаэробное дыхание, ΔрН/г белка/мин / Anaerobic respiration, ΔpH/g protein/min
ло г / CG S	69,0 (58,3– 74,1)	2,1 (1,85–2,7)	2,2 (2,0–4,5)	1,5 (1,2–1,6)	88,2 (86,6– 88,5)	6,2 (5,5–6,9)
ЛО 9 / CG 9	68,5 (62,0– 73,5)	2,3 (1,83–2,4)	2,5 (1,6–2,9)	1,2 (1,1–1,4)	87,3 (86,2– 87,7)	6,1 (5,3–6,8)
БА Й / AD S	272,8 (264,9– 281,8)*	7,1 (6,8–7,8)*	7,0 (6,9–8,6)*	5,4 (4,6–5,8)*	30,2 (28,9– 31,4)*	17,5 (16,8– 19,1)*
БА 9 / AD 9	273,0 (267,5– 289,4)#	7,7 (7,3–8,1)#	7,9 (7,5–8,2)#	5,2 (4,4–5,7)#	26,7 (25,9– 27,1)#	19,1 (17,1– 20,8)#

Примечание / Note: S — крысы самцы / male rats; ? — крысы самки / female rats; * — статистически значимые различия с ЛО группой крыс самцов (тест Манна-Уитни) / statistically significant differences with the CG male rats group (Mann-Whitney test); # — статистически значимые различия с ЛО группой крыс самок (тест Манна-Уитни) / statistically significant differences with the CG female rats group (Mann-Whitney test), AD — Alzheimer's disease, CG — control group.

3,8 мм, медиально-латеральная — 2 мм, дорсально-вентральная — 2,6 мм от брегмы; установка RWD Life Science (КНР)) [10]. Развитие БА подтверждали в ходе оценки пространственной рабочей памяти крыс в тесте Y-образный лабиринт [11].

Через 60 дней животных декапитировали, извлекали головной мозг, механически отделяли гиппокамп (m=10 мг). Подготовка биоматериала для анализа и проведённый в дальнейшем респирометрический анализ соответствовали таковым, описанным ранее [12]. Также в супернатанте головного мозга определяли изменение концентрации SMAC/DIABLO, АИФ, цитохрома С и митохондриального пероксида водорода (MitoH2O2). Содержание SMAC/DIABLO, АИФ, цитохрома С оценивали методом иммунофермент-ного анализа (ИФА) с использованием видоспецифичных наборов производства CloudClone (КНР) и системы микропланшетного ридера Infinite F50 (Tecan, Австрия). Концентрацию MitoH2O2 опреде- ляли в реакции с резазурином (набор реактивов AmplexRed, Thermo Fisher Scientific, Германия). Статистический анализ полученных результатов производили с применением пакета статистического анализа «Statplus 7.0» (AnalystSoft Inc., США, лицензия 16887385). Данные выражали в виде Me (Q1-Q3). Межгрупповые отличия определяли с использованием U-теста Манна-Уитни при уровне значимости p<0,05. Сравнение регрессионных моделей производили с использованием критерия Фишера, информационного критерия Акаике и коэффициента детерминации R2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования было показано, что у группы крыс самцов с экспериментальной БА в ткани гиппокампа наблюдается повышение (относительно ЛО животных) концентрации SMAC/DIABLO, АИФ и цитохрома С в 3,9 (p=0,034); 3,4 (p=0,026) и 3,2 (p=0,018) раза, соответственно (табл. 1).

Таблица 2 / Table 2 Результаты регрессионного анализа зависимости концентрации SMAC/DIABLO, АИФ и цитохрома С от содержания Mito H2O2 и показателей активности клеточного дыхания у крыс самцов с экспериментальной болезнью Альцгеймера / Results of regression analysis of the dependence of SMAC/DIABLO, Apoptosis-inducing factor, and cytochrome c concentrations on Mito H2O2 content and cellular respiration activity in male rats with experimental Alzheimer’s disease

Зависимость / Dependence	R2	F	p	Критерий Акаике / Akaike criterion
SMAC/DIABLO — Mito H2O2	0,9085	79,4012	<0,0001	5,55
SMAC/DIABLO — Аэробное дыхание / SMAC/DIABLO — Aerobic respiration	0,8612	49,6390	0,0001	5,97
SMAC/DIABLO — Анаэробное дыхание / SMAC/DIABLO — Anaerobic respiration	0,8059	33,2158	0,0004	6,31
АИФ — Mito H2O2 / Apoptosis-inducing factor — Mito H2O2	0,9529	161,7883	<0,0001	-0,01
АИФ — Аэробное дыхание / Apoptosis-inducing factor — Aerobic respiration	0,9184	90,0000	<0,0001	0,54
АИФ — Анаэробное дыхание / Apoptosis-inducing factor — Anaerobic respiration	0,8011	32,2225	0,0005	1,43
Цитохром С — Mito H2O2 / Cytochrome c — Mito H2O2	0,7964	31,2921	0,0005	1,53
Цитохром С — Аэробное дыхание / Cytochrome с — Aerobic respiration	0,8205	36,5609	0,0003	1,41
Цитохром С — Анаэробное дыхание / Cytochrome с — Anaerobic respiration	0,8264	38,0769	0,0003	1,37

В то же время у крыс самцов с БА содержание Mito H2O2 быловыше аналогичного у ЛО крыс в 3,6 раза (p=0,042), при этом активность аэробного дыхания уменьшилась на 65,8% (p=0,041), а анаэробного — увеличилась в 2,8 раза (p=0,023). У крыс самок с экспериментальной БА отмечено повышение содержания в ткани гиппокампа SMAC/DIABLO, АИФ, цитохрома С и Mito H2O2 по отношению к группе ЛО животных в 4,0 (p=0,025), 3,4 (p=0,019), 3,2 (p=0,021) и 4,3 (p=0,029) раза, соответственно. У крыс самок с БА активность анаэробного дыхания увеличилась в 3,1 раза (p=0,014), а аэробного, напротив, уменьшилась на 69,4% (p=0,043).

Проведённый регрессионный анализ зависимости изменения концентрации митохондриальных проапоптотических молекул от содержания Mito H2O2 и процессов клеточного дыхания позволил установить, что у крыс самцов (табл. 2) с БА наиболее достоверной моделью, описывающей измене- ние концентрации SMAC/DIABLO и АИФ, является зависимость от содержания Mito H2O2. Напротив, изменение концентрации цитохрома С в большей степени зависит от активности анаэробных процессов.

У крыс самок (табл. 3) была отмечена тенденция, аналогичная самцам. Так, изменение содержания проапоптотических молекул SMAC/DIABLO и АИФ в наибольшей степени зависело от концентрации Mito H2O2. Содержание цитохрома С в ткани гиппокампа крыс самок с экспериментальной БА в наибольшей степени зависело от активности анаэробного дыхания (табл. 3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Реакции апоптоза являются неотъемлемой частью патогенеза многочисленных заболеваний, в том числе носящих нейродегенеративный характер, например, БА. В настоящее время обще-

Таблица 3 / Table 3 Результаты регрессионного анализа зависимости концентрации SMAC/DIABLO, АИФ и цитохрома С от содержания Mito H2O2 и показателей активности клеточного дыхания у крыс самок с экспериментальной болезнью Альцгеймера / Results of regression analysis of the dependence of SMAC/DIABLO, Apoptosis-inducing factor, and cytochrome c concentrations on Mito H2O2 content and cellular respiration activity in female rats with experimental Alzheimer’s disease

Зависимость / Dependence R2 F p Критерий Акаике / Akaike criterion SMAC/DIABLO — Mito H2O2 0,8686 52,9059 <0,0001 6,1636 SMAC/DIABLO — Аэробное дыхание / SMAC/DIABLO — Aerobic respiration 0,7341 22,0809 0,0015 6,8690 SMAC/DIABLO — Анаэробное дыхание / SMAC/DIABLO — Anaerobic respiration 0,8503 45,4460 0,0001 6,2942 АИФ — Mito H2O2 / Apoptosis-inducing factor — Mito H2O2 0,8728 54,9049 <0,0001 0,4945 АИФ — Аэробное дыхание / Apoptosis-inducing factor — Aerobic respiration 0,8151 35,2754 0,0003 0,8685 АИФ — Анаэробное дыхание / Apoptosis-inducing factor — Anaerobic respiration 0,7963 31,2696 0,0005 0,9657 Цитохром С — Mito H2O2 / Cytochrome c — Mito H2O2 0,9160 87,2329 <0,0001 -0,6825 Цитохром С — Аэробное дыхание / Cytochrome с — Aerobic respiration 0,6837 17,2892 0,0032 0,6434 Цитохром С — Анаэробное дыхание / Cytochrome с — Anaerobic respiration 0,9636 211,8715 <0,0001 -1,5192 признано, что массовая гибель нейронов и глиальных клеток у пациентов с БА протекает по механизмам апоптоза, что, в свою очередь, открывает определённые перспективы для целенаправленного терапевтического воздействия. Несмотря на перспективность изучения апоптоза в качестве терапевтической мишени для патогенетического лечения БА, углублённому исследованию апопто-тических реакций уделяется не столь пристальное внимание. Как правило, данный процесс рассматривается в контексте сопряжённого каскада амилоидогенеза и нейровоспаления [13]. Также стоит отметить, что большинство доклинических исследований, в которых анализируется ход апо-птотического процесса при БА, выполнено на крысах-самцах, что в свою очередь актуализирует оценку пол-ассоциированных изменений реакций апоптоза.

В связи с этим было проведено исследование, посвящённое изучению зависимости высвобождения молекул-биомаркеров внутреннего пути апоптоза от основных проапоптотических митохондриальных стимулов: образования активных форм кислорода и изменения клеточного дыхания.

В результате было показано, что у крыс обоего пола высвобождение белка SMAC/DIABLO и АИФ находится в большей зависимости от изменения содержания Mito H2O2, тогда как рилизинг цитохрома С зависит от активности анаэробных процессов. Полученные результаты согласуются с гипотезой «митохондриального каскада» патогенеза БА, описанной Ashleigh et al. Данная концепция предполагает, что образование патологичных форм Аβ, нейрофибриллярных агрегатов тау-белка и синаптическая дисфункция находятся в тесной взаимосвязи с нарушением биоэнергетики клетки, генерацией активных форм кислорода и апоптозом [14]. Также необходимо отметить отсутствие значимых отличий концентрации биомаркеров апоптоза (SMAC/DIABLO — p=0,098; АИФ — p=0,12 цитохром С — p=0,25) и MitoH2O2 (p=0,19) и показателей клеточного дыхания (аэробное — p=0,096; анаэробное — p=0,085) между самцами и самками с экспериментальной БА, что согласуется с данными, полученными Lopez-Lee et al. [15].

Проведённый регрессионный анализ позволил установить, что высвобождение из дефектных митохондрий SMAC/DIABLO и АИФ в большей степени зависит от способности митохондрий генерировать АФК. Данный факт может объясняться особенностями их локализации в митохондриальном матриксе [16], а также способностью А β повреждать митохондриальные мембраны с образованием проапоптотического 4-гидроксиноненаля [17]. В то же время высвобождение цитохрома С сопряжено с активацией анаэробного метаболизма, что, по всей видимости, связано с его непосредственным участием в реакциях окислительного фосфорилирования, дисбаланс которых отмечается при наличии митохондриальной дисфункции [18]. Стоит отметить, что значимых пол-ассоциированых отличий течения реакций апоптоза у крыс с экспериментальной БА установлено не было.

Отсутствие пол-ассоциированных отличий реакций окислительного стресса, апоптоза и клеточного дыхания, вероятно, связано с особенностями действия Аβ на головной мозг животных при наличии сопутствующих генетических дефектов. Например, в работе Chaudry et al. (2022) показано, что самки крыс TgF344-AD по сравнению с самцами более склонны к когнитивным нарушениям, но в то же время у самок наблюдается менее выраженное (по сравнению с самцами) повреждение гиппокампа. Таким образом, можно предположить, что лабораторные животные с мутацией генов белка-предшественника амилоида и пресенилина (линия животных TgF344-AD) характеризуются диффе- ренциацией патофизиологических особенностей течения БА (наиболее выражены у самцов) и проявлением симптомов, характерных для данного заболевания (наиболее выражены у самок) [19].

В отличие от трансгенных животных (у которых симптомы заболевания, например, когнитивный дефицит, более выражены у самок), для животных «дикого фенотипа» не характерны выраженные пол-ассоциированные патофизиологические особенности течения БА [20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённое исследование показало, что у крыс обоего пола с экспериментальной БА в ткани гиппокампа отмечается сопоставимое повышение, относительно ложнооперированных животных, концентрации молекул-индукторов внутреннего пути апоптоза: SMAC/DIABLO, АИФ и цитохрома С. При этом, основываясь на результатах регрессионного анализа, можно предположить, что высвобождение SMAC/DIABLO и АИФ связано с генерацией АФК, а цитохрома С — с активностью анаэробных процессов. Результаты данного исследования можно использовать в ходе доклинической оценки новых нейропротекторных соединений, избирательно подавляющих реакции митохондриального пути апоптоза.

Финансирование: Авторы заявляют об отсутствии финансирования.