Ретроспективный анализ 563 эмбриологических протоколов криоциклов: влияние компетенции ооцитов и генетического скрининга эмбрионов человека на результаты витрификации

Введение . Вспомогательные репродуктивные технологии (далее - ВРТ) наиболее убедительно демонстрируют успехи фундаментальной науки в практической медицине. Современные технологии отбора гамет и эмбрионов, оплодотворение in vitro, продленное культивирование, time-lapse технология, криоконсервация биологического материала позволяют при наличии разных форм бесплодия у пациентов достигать наступления беременности и приводят к рождению здоровых детей [1-5]. В настоящее время по разным данным, в мире насчитывается от 8 до 10 миллионов рожденных детей [2, 4, 6]. Но, несмотря на все успехи, только 30% начатых циклов ВРТ заканчиваются рождением ребенка. Именно поэтому идет постоянный поиск новых инвазивных и не инвазивных методов отбора наиболее перспективных к имплантации эмбрионов. Современная технология NGS – Next Generation Sequencing – метод прямого анализа генома эмбриона, позволяет проводить скрининг всех 46 хромосом на структурные перестройки и количественные изменения, исключив эмбрионы с генетическими нарушениями для последующего переноса. Многочисленные исследования последних лет приводят убедительные данные преимущества генетического скрининга эмбрионов на анэуплоидии при отборе эмбрионов для переноса в полость матки, особенно у пациентов старше 35 лет [7-9]. По данным литературы в ооцитах женщины после 35 лет возрастает уровень структурных и количественных аномалий хромосомного аппарата. Именно по этой причине частота наступления беременности в этой возрастной группе крайне низкая [8, 10]. В связи с этим рекомендуется использование донорских ооцитов в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения РФ от 30 августа 2012 г. N 107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» [11].

Цель исследования : анализ целесообразности выполнения генетического скрининга эмбрионов (Next Generation Sequencing - NGS) и сравнительный анализ эффективности использования донорских и собственных ооцитов при переносе одного эмбриона в криоциклах.

Материалы и методы исследования. Проведен ретроспективный анализ криопротоколов циклов, проведенных в ЗАО «Медицинская компания ИДК». Для исследования были выбраны 4 группы пациентов с переносом одного эмбриона (SET – single embryo transfer): циклы с проведением NGS тестирования, в которых для отбора на перенос были взяты эмбрионы с генетически эуплоидным статусом с использованием собственных ооцитов (1 группа, n=20); циклы с переносом одного эмбриона без применения

NGS и использованием собственных ооцитов (2 группа, n=446); циклы без применения NGS, с использованием донорских ооцитов (3 группа, n=8). 1, 2 и 3 группы имели сопоставимый возраст (34,1 - 34,3 - 34,6 лет). 4 группа наблюдения (циклы без применения NGS, с использованием донорских ооцитов, n=62) была выделена дополнительно, в связи с малочисленностью 3-й группы, средний возраст пациентов составил 42,3 года. Всего проанализировано 536 криоциклов.

В работе были использованы эмбрионы человека, исследование которых было проведено с соблюдением международных этических и правовых норм обращения с эмбрионами человека [ст. 18 Конвенции Совета Европы о защите прав человека и достоинства человеческого существа при использовании достижений биологии и медицины, 1997]. Использование в научных исследованиях эмбрионов человека было разрешено Комитетом по биоэтике при Самарском государственном медицинском университете (выписка из протокола № 116 от 3.10.2018 г.).

Для оценки структуры ооцитов и эмбрионов был использован морфологический метод оценки качества эмбрионов с применением инвертированного микроскопа OlympusIX-73 (Япония) и стереомикроскоп Nikon SMZ-1000 (Япония). Витрификация эмбрионов осуществлялась в соответствии с протоколом замораживания/оттаивания завода-производителя (Irvine Scientific, USA). Для оценки жизнеспособности эмбриона проводили его морфологическую оценку сразу после размораживания (рис. 1) и через 2 часа после размораживания (рис. 2). На перенос были взяты эмбрионы, у которых количество не поврежденных клеток составляло более 50%.

Рис. 1. Эмбрион человека 5-х суток развития, стадия сколлапсированной бластоцисты человека, сразу после размораживания. Ув.: х200.

Рис. 2. Эмбрион человека 5-х суток развития, стадия бластоцисты человека через 2 часа после после размораживания. Ув.: х200.

Биопсию эмбрионов проводили на 5-6 сутки доимплантационного развития эмбрионов. Для биопсии клеток трофобласта были отобраны бластоцисты категории не менее 3ВВ в соответствии с оценкой по системе Gardner et Schoolcraft [12].

Статистическую обработку результатов выполняли на компьютере в среде статистических вычислений R (Rv.3.5.3, Studiov.1.1.463), первичный ввод данных производили с помощью электронных таблиц MS Excel. Использовали методы описательной статистики, тесты для сравнения пропорций, в том числе точный биноминальный для малых выборок и одновыборочный тест пропорций с коррекцией непрерывности для больших выборок. Контрольными точками были определены: частота выживаемости эмбрионов после витрификации, частота положительного выявления хорионического гонадотропина человека ХГЧ(+) в крови, частота наступления беременности (ЧНБ) и частота имплантации (ЧИ) у пациентов во всех исследованных группах.

Результаты и обсуждение . В предыдущих публикациях нами были описаны результаты витрификации эмбрионов в зависимости от уровня их организации, корреляция между стадией развития бластоцисты и уровнем выживаемости, а также ЧНБ и ЧИ [1]. Для оценки влияния витрификации на развивающиеся эмбрионы, подвергающиеся предварительной биопсии эмбриона с забором 3-5 клеток трофобласта, проанализированы результаты выживаемости бластоцист. Биопсия эмбрионов сама по себе является инвазивной процедурой, имеющей риски его повреждения и остановки их в развитии. Полученные в ходе исследования данные приведены в таблице 1.

Таблица 1

Показатели выживаемости эмбрионов и клинической эффективности программ ВРТ

Примечание: * - в столбце различия указан номер группы, с которой имеются статистически значимые различия

Как видно из таблицы, частота выживаемости эмбрионов в 1 группе составила 100%. Это свидетельствует о том, что витрификация не ухудшает качество и жизнеспособность эмбриона после биопсии. Максимальная выживаемость может быть также связана с предварительной селекцией и корректным отбором эмбрионов для биопсии. При сопоставлении данных по выживаемости эмбрионов мы получили статистически значимые отличия между 1-й и 3-й группами, а также между 2-й и 3-й группами. Таким образом, выживаемость в группе с использованием донорских клеток (3) была значимо ниже, чем в группах с собственными клетками (1 и 2). Возраст реципиентов в группах (3 и 4) с донорскими клетками на частоту выживаемости не влиял. По результатам ХГЧ(+) -наиболее низкие показатели были получены во 2-й группе (с использованием собственного генетического материала без проведения генетического скрининга). Значимо различаются данные между 2-й и 3-й, 2-й и 4-й группами.

По показателям ЧНБ и ЧИ обнаружены сопоставимые показатели в 1-й, 3-й и 4-й группах. Это свидетельствует о том, что генетический скрининг позволяет получить при использовании собственных ооцитов сопоставимые клинические результаты с группами, в которых были использованы донорские ооциты (вне зависимости от возраста реципиентов). Кроме того, этот факт является дополнительным доказательством определяющей роли компетенции ооцита в реализации репродуктивного потенциала.

Статистически значимые отличия по ЧНБ и ЧИ демонстрируют данные между 1-й и 2-й группами (почти в 2 раза), что дополнительно показывает преимущества генетического скрининга и эффективность переноса эуплоидного эмбриона в полость матки при использовании собственного генетического материала. Статистически значимая разница клинических показателей 2-й и 3-й групп позволяет сделать очевидный вывод о преимуществе применения донорского материала по сравнению с использованием собственного, без сопутствующего генетического тестирования на анеуплоидии в одной и той же возрастной группе. Клинические показатели эффективности криопротоколов (частота ХГЧ (+), ЧНБ, ЧИ) показывают преимущества переносов после NGS и в группах с использованием донорских ооцитов.

Заключение . Таким образом, комплексный анализ влияния компетенции ооцитов, генетического скрининга и витрификации на частоту выживаемости эмбрионов, клинические показатели у пациентов, позволяет сделать следующие выводы. Процесс витрификации не оказывает негативного влияния на качество и жизнеспособность эмбрионов, в том числе и после проведенной биопсии эмбрионов, а качество ооцитов, их уровень плоидности являются определяющими прогностическими факторами наступления беременности. Генетический скрининг на анеуплоидии значительно улучшает клинические показатели и результаты, делая их сопоставимыми с аналогичными у пациентов с использованием донорских ооцитов.

Авторы сообщают об отсутствии каких-либо конфликтов интересов при планировании, выполнении, финансировании и использовании результатов настоящего исследования.