Риск формирования аллергии и ее иммунные фенотипы у детей с полиморфизмом гена MMP9 Q279R

Старкова Ксения Геннадьевна – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией иммунологии и аллергологии (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Долгих Олег Владимирович – доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Легостаева Татьяна Андреевна – врач клинической лабораторной диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Ухабов Виктор Максимович – доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей гигиены (e-mail: ; тел.: 8 (342) 235-11-35; ORCID: .

воздействием факторов окружающей среды, которое способствовало резкому росту этой тенденции за последние пять десятилетий. Применение близнецового метода показало, что генетический вклад в аллергические заболевания составляет около 50 % с оценкой наследуемости в 33–95 % [1, 2]. Поэтому научные исследования с использованием современных молекулярно-генетических методов, направленных на выявление индивидуальной генетической вариабельности в контексте развития аллергопатологии, представляются важным этапом реализации программ по раннему выявлению и предотвращению риска развития данной группы заболеваний [3, 4].

Матриксные металлопротеиназы относятся к семейству цинк-зависимых эндопептидаз, которые играют важную роль в процессах тканевого ремоделирования и деградации различных белков во внеклеточном матриксе, способны воздействовать на биологически активные молекулы и регулировать клеточные и сигнальные пути как при нормальных физиологических условиях, так и при патологических процессах. Желатиназа В (MMP-9) является основным участником протеолитической деградации внеклеточного матрикса, а также множества нематриксных белков, модулируя эмбриональный рост и развитие, ангиогенез, сосудистые заболевания, воспаление, инфекционные процессы, опухолевую прогрессию, различные аспекты иммунного ответа, апоптоз, клеточную пролиферацию, дифференцировку и миграцию иммунных клеток, высвобождая цитокины и факторы роста [5, 6]. Высокая степень полиморфности генов мат-риксных металлопротеиназ и носительство различных аллельных вариантов, определяющих уровень ферментативной активности, а также внешние факторы, способствующие реализации наследственной информации (например, ароматические углеводороды), могут рассматриваться в качестве потенциальных участников патологических процессов, в том числе и аллергических (атопических) заболеваний [7, 8].

Цель исследования – выявить особенности иммунной регуляции, ассоциированной с Q279R полиморфизмом гена MMP9 (rs17576) и контаминацией биосред бензолом, у детей с аллергическими заболеваниями.

Материалы и методы. Проведено обследование детского населения школьного возраста, проживающего в Уральском регионе, группу наблюдения составили 33 ребенка (средний возраст 12,0 ± 0,5 г.; 15 мальчиков и 18 девочек) с диагнозами атопического дерматита, аллергического контактного дерматита, аллергического ринита, астмы с преобладанием аллергического компонента. В группу сравнения вошли 40 относительно здоровых детей (средний возраст 12,8 ± 0,45 г.; 13 мальчиков и 27 девочек). Группы были сопоставимы по полу, возрасту, этнической принадлежности ( p < 0,05).

Все законные представители обследованных детей подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (пересмотр 2013 г.) и одобрено этическим комитетом ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения».

Присутствие ароматических углеводородов (бензол) в биосредах детей определяли газохроматографическим методом на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором «Кристалл 5000» (Россия). Соотношение основных популяций лейкоцитов определяли на гематологическом анализаторе Drew-3 (США). Фракции лимфоцитов по мембранным CD-маркерам определяли на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) на панелях меченых моноклональных антител с помощью универсальной программы CellQuestPro, суммарно регистрируя не менее 10 тысяч событий. Уровни IgE общего, интерлейкинов (IL-1 β , IL-6, IL-4, IL-10), интерферона-гамма (IFN- γ ), фактора некроза опухолей (TNF- α ) определяли иммуноферментным методом на анализаторе ELx808IU (BioTek, США) с помощью коммерческих тест-систем («Вектор-Бест», «Хема», Россия) согласно методике производителя.

Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения Statistica 10.0 (StatSoft, США). Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего ( M ± m ) или количества (%). Достоверность различий между группами определяли по средним значениям согласно t -критерию Стьюдента, различия считали значимыми при уровне р < 0,05.

Биоматериал для генетического анализа получали со слизистой оболочки ротоглотки, ДНК выделяли сорбентным методом. Полиморфизм матрикс-ной металлопротеиназы-9 MMP9 Q279R (rs17576) определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на термоциклере CFX96 (Bio-Rad, США) с применением наборов «SNP-скрин» («Синтол», Россия). Полученные данные обрабатывали с помощью программы «Ген Эксперт», частоты генотипов рассчитывали по равновесию Харди – Вайнберга. Достоверность межгрупповых различий определяли по критерию хи-квадрат (χ²) при уровне значимости р < 0,05, данные по частотам аллелей анализировали методом логистического регрессионного анализа с расчетом отношения шансов OR (odds ratio) и 95%-ного доверительного интервала (95 % CI ), а также относительного риска RR (relative risk) и 95%-ного доверительного интервала (95 % CI ).

Исследования проводили в соответствии со стандартами организации и методическими указаниями.

Результаты и их обсуждение. Результаты химико-аналитических исследований позволили уста- новить повышенный уровень контаминации крови бензолом у детей группы наблюдения, превышающий аналогичные значения в группе сравнения в 2,7 раза (группа наблюдения – 0,000566 ± 0,00015 мкг/см3; группа сравнения – 0,000213 ± 0,00011 мкг/см3; р = 0,024). Выявлен повышенный уровень специфической чувствительности к бензолу по критерию содержания специфических IgG к бензолу у 78,8 % детей группы наблюдения относительно референтного уровня (р = 0,000), который превышал значения показателей группы сравнения в 1,8 раза (группа наблюдения – 0,378 ± 0,051 усл. ед.; группа сравнения – 0,208 ± 0,036 усл. ед.; референтный уровень < 0,015 усл. ед.).

Результаты обследования детей группы наблюдения показали изменение регуляторных иммунных показателей (табл. 1), определяемое соотношением основных популяций иммунокомпетентных клеток при повышении абсолютного количества лейкоцитов в 1,2 раза, эозинофилов – в 1,9 раза и возрастании эозинофильно-лимфоцитарного индекса – в 2,1 раза ( р = 0,002–0,014). Выявлено повышение популяций CD3⁺- и CD4⁺-лимфоцитов на 15 и 11 % соответственно относительно показателей группы сравнения ( р = 0,032–0,043).

Отмечено повышение уровня общей сенсибилизации по критерию содержания IgE общего в группе детей с аллергопатологией в 4,2 раза относительно данных группы сравнения ( р = 0,006). Изменения маркеров цитокиновой иммунной регуляции выявлены по содержанию IL-4 и TNF- α с повышением показателей в среднем в 1,6 и 1,2 раза соответственно ( р = 0,013–0,03).

Результаты генетического анализа (табл. 2) продемонстрировали особенности распределения аллелей и генотипов Q279R полиморфизма гена MMP9 у детей с аллергическими заболеваниями c повышением частоты вариантного гомозиготного генотипа GG и гетерозиготного генотипа AG в 1,7 раза относительно данных группы сравнения ( р = 0,03). При этом аллель G Q279R полиморфизма гена MMP9 может рассматриваться в качестве маркера чувствительности и фактора риска развития аллергопатологии у детей (OR = 2,34; 95 % CI = 1,17–4,65), в то время как аллель A выступает в качестве протектив-ного фактора и сопряжен с минимизацией риска формирования аллергии ( OR = 0,43; 95 % CI = 0,22–0,85). Логистический регрессионный анализ выявил адекватность доминантной модели ( p = 0,01) и показал возможную ассоциацию носительства генотипов AG и GG Q279R полиморфизма гена MMP9 с развитием аллергических заболеваний ( OR = 3,61; 95 % CI = 1,34–9,71). Распределение частот аллелей и генотипов соответствовало равновесию Харди – Вайнберга (χ ² = 0,01–1,16; p = 0,28–0,9).

При оценке генотип-ассоциированных изменений иммунной регуляции в группе наблюдения детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от Q279R полиморфного варианта гена MMP9 (табл. 3) выявлено достоверное увеличение относительного количества эозинофилов в 1,6 раза, возрастание маркера сенсибилизации IgE общего в 2,8 раза, повышение цитокиновых медиаторов IL-4 и TNF- α в 1,4 и 1,3 раза соответственно у носителей вариантного аллеля G относительно обладателей гомозиготного генотипа AA ( р = 0,020–0,042).

Таблица 1

Особенности иммунного профиля обследованных детей с аллергическими заболеваниями

Показатель	Референтный уровень	Группа наблюдения	Группа сравнения	p
Лейкоциты, 109/дм3	3,9–6	6,36 ± 0,68	5,41 ± 0,37	0,014
Эозинофилы, шт.	35–350	263,94 ± 78,81	142,18 ± 37,64	0,008
Эозинофилы, %	0–3	4,03 ± 0,96	2,6 ± 0,64	0,014
CD19+-лимфоциты, 109/дм3	0,09–0,66	0,29 ± 0,04	0,27 ± 0,03	0,422
CD19+-лимфоциты, %	6–25	12,46 ± 1,39	12,6 ± 1,15	0,874
CD3+-лимфоциты, 109/дм3	0,69–2,54	1,63 ± 0,17	1,42 ± 0,09	0,032
CD3+-лимфоциты, %	55–84	66,7 ± 2,60	66,15 ± 1,983	0,737
CD3+CD4+-лимфоциты, 109/дм3	0,41–1,59	0,89 ± 0,11	0,76 ± 0,06	0,043
CD3+CD4+-лимфоциты, %	31–60	36,15 ± 2,48	35,65 ± 2,13	0,760
IgE общий, МЕ/см3	0–99,9	181,39 ± 94,68	43,11 ± 20,82	0,006
IL-10, пг/см3	0–20	4,10 ± 1,77	3,16 ± 0,73	0,317
IL-1 β , пг/см3	0–11	3,23 ± 1,11	1,87 ± 1,19	0,060
IL-4, пг/см3	0–4	1,9 ± 0,36	1,20 ± 0,25	0,013
IL-6, пг/см3	0–10	2,50 ± 0,92	1,51 ± 0,41	0,890
INF- γ , пг/см3	0–10	3,44 ± 2,41	1,57 ± 0,32	0,126
TNF- α , пг/см3	0–6	2,11 ± 0,26	1,7 ± 0,26	0,030

П р и м е ч а н и е : p – уровень значимости различий группы наблюдения с группой сравнения по t -критерию Стьюдента.

Таблица 2

Особенности генетического полиморфизма MMP9 Q279R у обследованных детей с аллергическими заболеваниями

Генотип, аллель	Группа наблюдения, %1 Группа сравнения, %п		χ2 1	p 1	OR (95 % CI)
Кодоминантная модель
AA	27,3	57,5	6,71	0,03	0,28 (0,10–0,75)
AG	51,5	30,0			2,48 (0,95–6,48)
GG	21,2	12,5			1,88 (0,54–6,61)
Мультипликативная модель
A	53,0	72,5	5,93	0,01	0,43 (0,22–0,85)
G	47,0	27,5			2,34 (1,17–4,65)
Доминантная модель
AA	27,3	57,5	6,71	0,01	0,28 (0,10–0,75)
AG+GG	72,7	42,5			3,61 (1,34–9,71)
Рецессивная модель
AA+AG	78,8	87,5	1,0	0,32	0,53 (0,15–1,86)
GG	21,2	12,5			1,88 (0,54–6,61)

П р и м е ч а н и е : p – уровень значимости межгрупповых различий; χ² – критерий хи-квадрат; OR – отношение шансов; 95 % CI – доверительный интервал.

Таблица 3

Показатели иммунорегуляции детей с аллергическими заболеваниями, ассоциированные с генотипами MMP9 Q279R

Показатель	Референтный уровень	Генотип		p
		AG+GG	AA
Лейкоциты, 109/дм3	3,9–6	6,15 ± 0,62	6,93 ± 2,15	0,440
Эозинофилы, шт.	35–350	292,54 ± 105,68	187,67 ± 70,99	0,098
Эозинофилы, %	0–3	4,5 ± 1,26	2,78 ± 0,84	0,023
CD19+-лимфоциты, 109/дм3	0,09–0,66	0,28 ± 0,04	0,33 ± 0,11	0,349
CD19+-лимфоциты, %	6–25	11,79 ± 1,52	14,22 ± 3,41	0,153
CD3+-лимфоциты, 109/дм3	0,69–2,54	1,65 ± 0,17	1,57 ± 0,50	0,750
CD3+-лимфоциты, %	55–84	67,5 ± 2,28	64,56 ± 8,54	0,464
CD3+CD4+-лимфоциты, 109/дм3	0,41–1,59	0,90 ± 0,12	0,854 ± 0,30	0,769
CD3+CD4+-лимфоциты, %	31–60	36,63 ± 2,96	34,89 ± 5,56	0,550
IgE общий, МЕ/см3	0–99,9	219,96 ± 128,29	78,55 ± 45,36	0,042
IL-10, пг/см3	0–20	4,58 ± 2,46	2,88 ± 1,18	0,207
IL-1 β , пг/см3	0–11	3,71 ± 1,57	2,25 ± 1,59	0,117
IL-4, пг/см3	0–4	2,08 ± 0,47	1,44 ± 0,29	0,020
IL-6, пг/см3	0–10	2,37 ± 0,81	2,91 ± 3,37	0,723
INF- γ , пг/см3	0–10	4,05 ± 3,37	1,89 ± 1,26	0,229
TNF- α , пг/см3	0–6	2,24 ± 0,30	1,69 ± 0,45	0,031

П р и м е ч а н и е : p – уровень значимости различий группы наблюдения с группой сравнения по t -критерию Стьюдента.

Сравнительный анализ показателей иммунного и аллергического статуса у детей с аллергопатологией, ассоциированной с аллелем G , относительно обладателей генотипа AA Q279R полиморфного варианта гена MMP9 позволил верифицировать тесты (эозинофилы, IgE общий, IL-4 и TNF- α ) и механизм (деградация внеклеточного матрикса) формирования аллергии, сопряженной с полиморфизмом гена мат-риксной металлопротеиназы Q279R MMP9 (rs17576), риск возникновения которой в условиях контаминации биосред бензолом у обладателей аллеля G возрастает в 2,1 раза по сравнению с носителями АА -генотипа ( RR = 2,08; 95 % CI = 1,13–3,83).

Негативные эффекты ароматических углеводородов, в частности бензола, на показатели иммунной реактивности связаны с иммунотоксиче-ским действием, степень выраженности которого определяется функциональными особенностями иммунокомпетентных клеток и стадией иммунного ответа. В результате контаминации биосред бензолом и дальнейших процессов его метаболизма возможно усугубление симптомов аллергии при активации, с одной стороны, развития окислительного стресса, а с другой стороны, стимуляции Th2-опосредованных процессов через усиление продукции IgE и IL-4 [9–11].

Известно, что механизмы формирования аллергических заболеваний ассоциированы с нарушениями иммунной регуляции, несбалансированной активацией аллерген-специфических Тh2-клонов, синтезом В-лимфоцитами IgE, инфильтрацией и активацией эозинофилов, базофилов и тучных клеток в очаге воспаления, мигрирующих через стенки капиллярных сосудов и интерстиций, что предъявляет особые требования к детерминированным мат-риксными металлопротеиназами процессам деградации внеклеточного матрикса [12, 13]. Считается, что MMP9 играет ключевую роль в ремоделировании и восстановлении тканей посредством деградации коллагена IV и V типов и эластина, что может способствовать миграции клеток. Однако в настоящее время биологические функции этих ферментов значительно расширены.

Матриксные металлопротеиназы играют ключевую роль в развитии иммунных клеток, эффекторной функции, миграции и лиганд-рецепторных взаимодействиях, влияя на иммунные ответы, в том числе через регуляцию сигнальных путей цитокиновых рецепторов (TNF- α , IL-6), связанных с развитием воспалительных процессов. Исследования на мышиных моделях с дефицитом ММР показывают, что в частности ММР9 секретируется воспалительными клетками после контакта с аллергеном и в ответ на сигнальные стимулы Th2-цитокинов, способствуя рекрутированию воспалительных клеток через мобилизацию провоспалительных цитокинов, хемо-кинов и факторов роста [14, 15]. Так, при астме эти медиаторы стимулируют выход воспалительных клеток из тканей в просвет дыхательных путей. ММР также способствуют гиперреактивности дыхательных путей и ремоделированию внеклеточного матрикса, влияя на сокращение гладких мышц, инвазию фибробластов и подслизистое накопление коллагена. MMP -индуцированная регуляция передачи клеточных сигналов посредством протеолитического отщепления и активации ключевых факторов роста, таких как TGF- β , стимулирует пролиферацию клеток дыхательных путей и модулирует выработку матрикса, способствуя развитию фиброза. Кроме того, MMP9 играет ключевую роль в инфильтрации эозинофилов через базальную мембрану в стенки дыхательных путей при астме и последующей индукции гиперреактивности. Уровни MMP9 в конденсате выдыхаемого воздуха у детей с астмой повышены и коррелируют со снижением легочной функции и другими маркерами воспаления, такими как IL-4 / IL-10 [16, 17].

Исследования показывают, что особую роль в поддержании аллергического воспаления со структурными фиброзными изменениями и интенсивной клеточной инфильтрацией у пациентов с аллергическим ринитом и атопическим дерматитом также играет MMP9, уровни экспрессии кото- рой и содержание в плазме крови достоверно выше [18, 19].

Ген ММР9 локализован в 20q11.2-q13.1 хромосоме и состоит из 13 экзонов. Полиморфизм Q279R гена ММР9 (rs17576) расположен в шестом экзоне в области коллагенсвязывающего домена фермента и связан с заменой аденина A на гуанин G в положении 836 ( 836 A/G ), в результате незаряженная аминокислота глутамин Q заменяется положительно заряженной аминокислотой аргинином R ( p.Gln279Arg ). Этот полиморфизм потенциально влияет на биологические свойства конечного белкового продукта, изменяя трехмерную структуру белка, что повышает аффинность к субстрату и эффективность связывания и в условиях изменения ферментативной активности MMP9 может потенцировать развитие патологических процессов, ассоциированных с повышенной функциональной активностью фермента [20, 21]. Исследования показывают, что вариант 279R ( G аллель) увеличивает активность ММР9 и ассоциирован с возрастанием риска сердечно-сосудистой патологии, астмы, хронической обструктивной болезни легких [22, 23].

Аллергические заболевания становятся одними из самых распространенных хронических заболеваний в современном обществе, своевременная диагностика и подбор адекватных стратегий лечения которых представляют серьезную проблему для здравоохранения в XXI в., поскольку недостаточная терапия приводит к значительному снижению работоспособности, влияя на здоровье и качество жизни людей. Существует необходимость всестороннего научного исследования возможных дополнительных и альтернативных подходов, которые позволят реализовать персонализированное направление в медицине с детальным изучением отдельных патогенетических звеньев и индивидуальной чувствительности организма на основе применения молекулярно-генетических методов прогнозирования и мониторинга развития заболевания [3, 24–26].

Выводы. Выполненное обследование детского населения с аллергопатологией показало нарушения иммунных регуляторных показателей на фоне повышения уровня контаминации биосред бензолом, связанные с изменением соотношения основных лейкоцитарных фракций, повышением эозинофильно-лимфоцитарного индекса, возрастанием уровня гиперчувствительности и цитокиновых иммунных медиаторов, которые указывают на Th2-направ-ленный сдвиг иммунного гомеостаза. Показаны ассоциации полиморфизма гена MMP9 Q279R с риском развития аллергических заболеваний, при этом аллель G может рассматриваться в качестве маркера чувствительности у детей с аллергопатологией ( OR = 2,34; 95 % CI = 1,17–4,65), а риск формирования аллергии у обладателей аллеля G увеличивается в 2,1 раза по сравнению с носителями АА -генотипа

(RR = 2,08; 95 % CI = 1,13–3,83). Таким образом, полиморфизм гена MMP9 Q279R (rs17576) у детей с проявлениями аллергии сопряжен с дисбалансом цитокинового профиля, а его аллель G ассоциирован с риском (RR = 2,1) формирования аллергии и может рассматриваться в качестве маркера чувствительности для задач ранней диагностики и профилактики атопических процессов у детей в условиях контаминации биосред бензолом.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.