Роль аберрантного метилирования в генах APC, RASSF1A и ITGA4 в диагностике колоректального рака

Колоректальный рак (КРР) является одной из основных причин заболеваемости раком и смертности во всем мире [1]. В России КРР занимает второе место по распространенности среди онкологических заболеваний [2].

«Золотым стандартом» диагностики КРР является колоноскопия – эндоскопическое исследование толстой кишки и терминального отдела подвздошной кишки при помощи специального гибкого эндоскопа. Данный метод обладает высокими показателями достоверности, однако сама по себе процедура достаточно болезненна и проводится с применением седации или внутривенного наркоза [3]. Также одним из недостатков колоноскопии является высокая стоимость этого метода диагностики. Учитывая перечисленные недостатки, применять колоноскопию для скрининга широких масс населения нецелесообразно.

В последнее время появляется все больше предложений по генетической диагностике КРР. В этом направлении особый интерес представляют эпигенетические маркеры, такие как профили микроРНК и аберрантное метилирование [4, 5].

Метилированная ДНК является достаточно информативным биомаркером. Наличие и количество метилированной ДНК можно детектировать в образцах крови или плазмы. Метилирование обширных регионов CpG-островков – основное эпигенетическое изменение, характерное для процессов канцерогенеза при КРР [6].

На настоящий момент на рынке представлены зарубежные коммерческие наборы для определения аберрантного метилирования генов SEPT9 и VIM, однако в России они используются только для научных целей, при этом отсут- ствует применение их в клинической практике.

Ранее нами была проведена работа по оценке параметров диагностическй модели из маркеров SEPT9 и VIM, которая показала высокую эффективность данного подхода [7]. В настоящей работе мы определяли наличие аберрантного метилирования в генах APC, RASSF1A и ITGA4 и оценивали возможность создания диагностической тест-системы на основе всех пяти биомаркеров.

Инактивация гена RASSF1A (Ras - ассоциированный домен семейства 1 изоформа А) влияет на развитие многих видов рака, при этом чаще всего подобная инактивация возникает вследствие аберрантного метилирования про-мотерного участка гена. Белок RASSF1A связан с процессами клеточного апоптоза и влияет на клеточный цикл, ингибируя аккумуляцию циклина D1. Таким образом, инактивация гена RASSF1A приводит к подавлению функции опухолевых супрессоров и ингибирует передачу сигнала к клеточному апоптозу [8].

APC белок является негативным регулятором концентрации бета-катенина и взаимодействует с Е-кадгерином, который отвечает за клеточную адгезию. По результатам многочисленных исследований аберрантное метилирование гена APC может приводить к развитию КРР [9–11].

Интегрин-альфа-4, продукт гена ITGA4, участвует в цитолитическом взаимодействии T-лимфоцитов с клетками-мишенями. Метилирование гена ITGA4 также влияет на развитие КРР [12].

При обследовании всех пациентов, включенных в данное исследование, был проведен анализ наличия мутаций в генах KRAS и NRAS. Гены KRAS и NRAS кодируют белки ГТФазы, играющих важную роль в передачах сигнала.

Продукты генов KRAS и NRAS являются ключевыми молекулами в нисходящем сигнальном пути рецептора человеческого эпидермального фактора роста (EGFR) — сложного сигнального каскада, принимающего участие в развитии и прогрессировании рака [13, 14].

Тестирование генов, кодирующих белки семейства RAS (KRAS и NRAS) позволяет отобрать пациентов с диким типом (без мутации) генов KRAS и NRAS, у которых можно достигнуть ответа при лечении моноклональными антителами, блокирующими белок EGFR [15].

В данном исследовании мы сопоставляли статус мутации генов семейства RAS с наличием аберрантного метилирования в выбранных нами генах.

Задачи этого исследования включали в себя анализ метилирования промотерных участков генов APC, RASSF1A и ITGA4 у пациентов с КРР и формирование высокоэффективной диагностической модели на основании полученных нами ранее и новых данных по метилированию.

Материалы и методы

Работа была одобрена локальным этическим комитетом, выполнена в соответствии с требованиями GCP (Good Clinical Practice) и Хельсинской декларацией по защите прав человека.

Исследование включало 150 парных образцов опухолевой ткани с известным статусом мутации генов семейства RAS и окружающей гистологически неизмененной ткани пациентов с аденокарциномой прямой кишки, проходивших лечение в Республиканском клиническом онкологическом диспансере Министерства здравоохранения Республики Татарстан в

Таблица 1

Клиническая характеристика пациентов

Пол	Количество
мужской	72
женский	78
Возраст
>50	124
<50	26
Cтадия опухоли
Т2M0	11
Т3M0	36
Т4М0	38
Т2М1	2
Т3М1	18
Т4М1	28

2008-2012 годах (табл. 1). Каждый пациент подписал добровольное информированное согласие на участие в проведении исследования. Опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза и описаны гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ). Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов. Отбирали образцы из первичных очагов с содержанием опухолевых клеток не менее 70%.

Выделение ДНК осуществлялось набором QIAamp DNA FFPE Tissue Kit («Qiagen», Германия), концентрацию суммарной ДНК в водном растворе оценивали на спектрофотометре NanoVue Plus («GE Healthcare», Великобритания). Бисульфитная конверсия и очистка проводились наборами EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit («Qiagen», Германия) с помощью автоматической станции пробоподготовки QIAcube («Qiagen», Германия). Изучение профилей метилирования производилось с помощью метода MethyLight PCR c олигонуклеотидами (табл. 2), подобранными на локусы, содержащими дифференциальнометилируемые CpG-островки, на приборе StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems («Applied Biosystems», США).

Статистический анализ данных проводили с применением точного критерия Фишера. Уровень значимости принят равным 0,05. Конкор-дантность данных по метилированию оценивали с помощью непараметрической ранговой корреляции Спирмана. Значимость корреляции по Спирману (Rs) проверяли с помощью t-теста Стьюдента: с числом степеней свободы ν = N-2, где N – размер выборки. Уровень значимости принят равным 10–6.

Чувствительность и специфичность маркеров оценивались с помощью ROC-анализа (MedCalc.2 software)

Результаты и обсуждение

Поиск и создание новых диагностических методов – одна из главных задач современной медицины, ориентированной на персональный подход к пациентам. Применение этих методов должно обеспечить успешный результат у индивидуума или популяции в целом, а также повлиять на решение врача в вопросах диагностики заболевания и ведения больного (лечения, реабилитации). Для характеристики информативности диагностических методов исследования

Таблица 2

Параметры праймеров и зондов для ПЦР в режиме реального времени

Ген Последовательность, 5’-3’ Длина продукта Условия реакции, 0С APC Праймер-FM,5'TAGTAAATAGTGAGTATTCGATAGATGTT3',56С Праймер-RM, 5' CGAACACTACTTCGCTATTCTATC 3',56С Зонд - ACCATTACTACCTAAACAACCGAATCTCAA-BHQ1, 61C 172 57 RASSF1A Праймер-FM, TTTCGTCGTTTAGTTTGGATTTTGG,58C Праймер-RM, CTCCCGCAACTCAATAAACTCAAA,59C Зонд - CCCGACATAACCCGATTAAACCCGTACTT -BHQ1, 66C 153 58 ITGA4 F: AAAGAATTGGACGGTTTTTC, 61C R: TATAACCCCAAACTACGCG, 63,4C Зонд - CGCTATAACCGCCCAACCCGA-BHQ1, 72C 110 72 служат такие параметры, как чувствительность (доля истинноположительных результатов среди всех проведенных тестов) и специфичность (доля истинноотрицательных результатов среди здоровых лиц в группе исследуемых).

В нашем исследовании подтвердилось наличие метилированных промотерных участков генов APC, RASSF1A и ITGA4. ДНК образцов опухоли было достоверно чаще метилировано, чем ДНК образцов прилежащей ткани. При этом наибольшая разница наблюдалась для гена ITGA4 (чувствительность 78%, специфичность 92,7%) (таблица 3). Метилирование в данных генах является результатом процесса канцерогенеза, при этом ген ITGA4 не является биологически значимыми маркером, однако ценность его как клинического маркера высока, так как в отличие от биологически значимых маркеров, таких как APC (чувствительность 32%, специфичность 93,3%) и RASSF1 (чувствительность 85,3%, специфичность 56,7%) обладает высокими показателями как чувствительности, так и специфичности.

При анализе образцов пациентов с КРР на наличие мутаций в генах KRAS или NRAS, 60% пациентов имели нормальную сигнальную систему EGFR и дикий тип гена KRAS; остальные 40% были носителями мутантного варианта генов семейства RAS. Из обнаруженных 40% мутаций только 10% приходится на ген NRAS, остальные мутации были детектированы в гене KRAS. Распределение частот типов мутаций полностью совпало с представленной информацией по ним в базах COSMIC, ENSEMBL и NCBI.

В данном исследовании мы анализировали наличие мутации в генах KRAS или NRAS

■ RAS+ I RAS-

Рис. 1. Процент метилированных образцов в зависимости от статуса мутации генов, кодирующих белки семейства RAS.

и аберрантного метилирования генов APC, RASSF1A и ITGA4. Полученные данные мы объединили с раннее установленными частотами аберрантного метилирования в генах SEPT9 и VIM. Таким образом, оказалось, что в группе пациентов, имеющих мутации в генах KRAS или NRAS, ДНК опухолевых образцов достоверно чаще метилировано в генах SEPT9 (p = 0.0018) и ITGA4 (p = 0.0044), в отличие от ДНК опухолевых образцов пациентов, не имеющих данные мутации (рис.1).

В рамках данной работы был рассчитан индекс метилирования для каждого образца и проверены параметры чувствительности и специфичности как для совокупности маркеров, так и для каждого маркера в отдельности. За пороговое значение для анализа совокупности маркеров был взят индекс метилирования, равный 0,4. Под индексом метилирования понимается отношение числа метилированных локусов к общему числу локусов модели. При этом значении система из маркеров имеет максимальные показатели чувствительности и специфичности (82,7% и 97,3% соответственно) (рис. 2). AUC, показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели, составляет 0,96, что говорит о высоком качестве модели. По сравнению с нашей предыдущей моделью, состоящей из маркеров SEPT9 и VIM [7], представленная модель, включающая пять маркеров, на 19,3% более специфична.

Эффективность диагностической тест-системы напрямую зависит от показателей, включенных в нее биомаркеров. Гены SEPT9, VIM, ITGA4 показали высокие значения обоих параметров. Для генов APС и RASSF1A высокий показатель был лишь у одного параметра. Тем не менее, в совокупности данные биомаркеры обеспечивают хороший диагностический результат. Учитывая то, что диагностическая система может быть основана на малоинвазивном методе определения статуса метилирования в плазме крови, можно предложить ее использование в обширных скрининговых программах, а также для оценки динамики заболевания у пациентов КРР.

Выводы

В нашей работе было проанализировано наличие метилирования в генах APC, RASSF1A и ITGA4 у пациентов с КРР. В образцах опухолевых тканей было подтверждено наличие метилирования CpG-островков в промотерных областях выбранных генов. Наибольшая разница в метилировании между опухолевой и здоровой тканью наблюдалась для гена ITGA4 (чувствительность 78%, специфичность 92,7%). Для гена APC (чувствительность составила 32%, специфичность – 93,3%), для гена RASSF1 (чувствительность была 85,3%, специфичность – 56,7%.

Ранее полученные данные по аберрантному метилированию генов SEPT9 и VIM и новые данные по генам APC, RASSF1A и ITGA4 мы сравнили со статусом мутации в генах KRAS и NRAS. Было обнаружено, что в группе пациентов, имеющих мутации в генах KRAS или NRAS, ДНК опухолевых образцов достоверно чаще метилировано в генах SEPT9 (p = 0.0018) и ITGA4 (p =

--ARC

— ITGA4

RASSF1A

-- SEPT9

....... VIM

Рис. 2. Сравнение результатов ROC-анализа для каждого маркера в отдельности и для совокупности маркеров.

0.0044), в отличие от ДНК опухолевых образцов пациентов, не имеющих данных мутаций.

При статистическом анализе эффективности диагностической тест-системы было показано, что наша модель, включающая в себя пять маркеров метилирования (APC, RASSF1A, ITGA4,

SEPT9 и VIM), обладает наилучшими показателями чувствительности и специфичности (82,7% и 97,3% соответственно). Полученную модель диагностической тест-системы предлагается использовать для скрининговых задач и оценки динамики КРР.