Роль циклинзависимых киназ 2, 4, 6 в процессе репарации инсулоцитов островков лангерганса поджелудочной железы

Сахарный диабет 1-го и 2-го типа является результатом недостаточного производства инсулина клетками панкреатических островков. Одним из стратегических направлений лечения диабета является разработка новых лекарственных средств, которые способны увеличивать количество в-клеток поджелудочной железы, а также стимулировать продукцию инсулина. Инсулоциты поджелудочной железы долго рассматривались как окончательно дифференцированные и необладающие тотипотентностью. Появляются данные, свидетельствующие о том, что они могут регенерировать [10]. Восстановление в-клеток может быть индуцировано различными путями, поэтому активно изучаются основы контроля клеточного цикла инсулоцитов. Имеющиеся данные указывают, что в-клетки у взрослых млекопитающих обычно возникают путем самовоспроизведе- ния, а также благодаря регенерации из стволовых клеток [10].

Предположение об отсутствии восстановления в -клеток основано на крайне медленной регенерации, которую практически невозможно отследить. Клетки взрослых мышей и крысре-генерируют со скоростью 0,07–3 % в сутки [8, 18]. Явление пролиферации инсулоцитов человека не столь хорошо изучено, однако есть данные, указывающие на то, что 0,04–1 % ядер в -клеток HomoSapiens окрашиваются маркером пролиферативной активности Ki-67 [3, 28].

Клеточный цикл состоит из нескольких фаз, в том числе S-фазы (фаза синтеза ДНК) и M-фазы (митотическая фаза). Во время S-фазы генетический материал реплицируется, а затем разделяется на две идентичные дочерние клетки после митотической М-фазы и цитокинеза. S- и M-фазы разделены двумя промежуточными фазами (G1 и G2), которые определяют готовность клеток к переходу в S- или M-фазу. Генетические и биохимические исследования показали, что деление клеток у эукариот контролируется циклинзависи-мыми киназами (CDK). Циклинзависимые киназы контролируют динамику клеточного цикла и являются основными регуляторами пролиферации эукариотических клеток [5, 7, 19, 34].

Также CDK имеют важное значение в регуляции транскрипции, эпигенезе, метаболизме и в развитии стволовых клеток [6, 16, 25, 27]. Активные CDK содержат субъединицу протеин-киназы, каталитическая активность которой зависит от ассоциации с регуляторной субъединицей циклина. Таким образом, клеточный цикл регулируется комплексами димерной киназы циклин-CDK, где CDK является субъединицей каталитической киназы, а циклин является активирующей субъединицей [24].

Циклинзависимые киназы фосфорилируют субстраты, главным образом, белки семейства ретинобластомы (RB), на специфических се-рин/треониновых сайтах фосфорилирования, что приводит к высвобождению транскрипционных факторов, которые модулируют экспрессию промоторов гена-мишени, что стимулирует ход клеточного цикла [30].

Пролиферация является основным компонентом для поддержания в -клеточной массы у взрослых мышей. Предполагается, что ингибиторы CDK могут также играть роль в угнетении пролиферации в -клеток [14, 33]. Ген CDKN2A, который кодирует ингибитор циклинзависимых киназ p16Ink4a, визуализируется во всех геномных исследованиях сахарного диабета [4]. Экспрессия белка p16Ink4a увеличивается в старых островках и сильно коррелирует с зависимым от возраста снижением уровня пролиферации и регенерации в -клеток [13]. Протеин p16Ink4a ингибирует активность нескольких CDK, включая CDK4, CDK6 и косвенно CDK2 [11]. Белок p16Ink4a способен регулировать пролиферацию, дифференцировку и старение клеток с помощью множественных сигнальных путей.

Комплексы CDK2/циклин E необходимы для пролиферации, так как они фосфорилируют белок ретинобластомы и стимулируют клетки посредством перехода из G1 в S-фазу клеточного цикла. Также CDK2 связывается с цик-лином А, который сам по себе важен для пролиферации клеток [6].

Самые ранние последствия делеции CDK2 включают нарушение функции в-клеток, а не снижение массы. С возрастом или в условиях чрезмерного питания потеря CDK2 снижает пролиферацию в-клеток и уменьшает их массу, что приводит к сахарному диабету [30].

CDK2 преимущественно экспрессируется в эндокринной части поджелудочной железы без видимой экспрессии в экзокринной ее части. Большая часть CDK2 экспрессируется в в -клетках и лишь небольшая часть в а-клетках. У мышей со специфической делецией CDK2 в поджелудочной железе развивается сахарный диабет, главным образом из-за дефектов секреции инсулина, стимулированной глюкозой, что приводит к прогрессирующему дефициту пролиферации в -клеток, уменьшению их массы, кроме того, возникают дефекты внутриклеточного метаболизма и нарушения структуры митохондрий [30].

Первые последствия делеции CDK2 проявляются в виде нарушения функций в -клеток, а не снижения клеточной массы. С возрастом или в условиях чрезмерного питания снижение уровня CDK2 приводило к уменьшению пролиферации в -клеток и снижению клеточной массы, что приводило к диабету, однако недостаток CDK2 не влияет на раннее развитие поджелудочной железы. Мыши с делецией CDK2 рождаются нормальными по размеру и массе по сравнению с контрольными однопометными, идентичными по возрасту и полу особями.

CDK2 отвечает за связывание и фосфорилирование фактора транскрипции FOXO1 по остатку Ser256 при глюкозозависимом пути активации синтеза инсулина. Индуцированное глюкозой фосфорилирование FOXO1-Ser256 является одним из механизмов активации PI3K [29]. Фактор транскрипции FOXO1 регулирует пролиферацию в -клеток путем индукции ключевых транскрипционных факторов в -клеток Neu-roD и MafA [30]. Таким образом, CDK2 служит важным связующим звеном, связывающим дисфункцию в -клеток с прогрессирующим уменьшением их количества при диабете [30, 12].

Активация путифосфоинозитид-3-киназы (PI3K)/Akt-киназы (serine threonine kinase Akt) является ключевым регулятором клеточной массы. Гиперэкспрессия Akt-киназы в клетках поджелудочной железы приводит к заметному увеличению размера и клеточной массы в-клеток за счет их пролиферации. Пролиферация в-клеток при гиперэкспрессии Akt-киназы была связана с повышенными уровнями циклина D1, циклина D2 и p21 и активностью CDK4 Предполагается, что Akt-киназа индуцирует пролиферацию клеток зависимым от CDK4 путем регуляции уровней циклина D1, циклина D2 и p21 [31]. Делеция одного аллеля CDK4 значительно снижает уровень пролиферации в-клеток, приводит к потере в-клеток поджелудочной железы и нарушению регуляции уровня глюкозы в крови у грызунов, что в конечном итоге приводит к диабету [2, 31]. Также у мышей с делецией CDK4 наблюдается снижение массы тела и органов, однако при стимулировании экспрессии эндогенного CDK4 в в-клетках и в гипофизе мышей запускается пролиферация. Тем не менее эти мыши остаются небольшими по размеру, такой фенотип является следствием уменьшения числа клеток, а не уменьшения их размера [14, 33].

Белки CIP/KIP, которые являются ингибиторами комплекса циклин E/CDK2, также связываются с комплексом циклин D/CDK4/6, и это приводит к дальнейшей активации CDK2 путем изолирования CIP/KIP от их мишени. Следовательно, комплекс циклин D/CDK4/6 представляет собой ключевой ферментный комплекс, который регулирует переход от фазы G1 к фазе S. Также p27kip является основным ингибитором клеточного цикла в клетках, так как он накапливается в ядрах клеток мышей с ожирением, ингибируя пролиферацию в -клеток [32].

При инфицировании островков лангерганса человека лентивирусным вектором, содержащим ДНК CDKR24C (ген, кодирующий белок CDK4), также наблюдалась более высокая скорость пролиферации. Аденовирусы, экспрессирующие CDK4 и циклин D1 в островках лангерганса крысы и человека, также приводят к усилению пролиферации в -клеток и фосфорилированию белка ретинобластомы [9]. Исследования трансгенных мышей, со сверхэкспрессией CDK4, выявили заметное увеличение пролиферации в -клеток, и у мышей не было признаков злокачественных новообразований островков поджелудочной железы в течение 18-месячного периода исследования [26]. Это указывает на то, что регуляция клеточного цикла является ключевым процессом в регенерации инсулоцитов, и CDK4 играет ведущую роль в пролиферации в -клеток мышей. Таким образом, CDK4 млекопитающих не только участвует в контроле пролиферации определенных типов клеток, но может играть более широкую роль в гомеостатической регуляции клеточной массы в органах. Данные, полученные из экспериментов на клеточных культурах, указывают на то, что циклинзависимая киназа 4 (CDK4) играет ведущую роль в качестве сигнальной молекулы в ранней стадии G1, регулируя переход от интерфазы к митозу. Активность CDK4 связана с циклинами D1, D2 и D3, синтез которых регулируется митогенными сигнальными путями [14, 33]. Индуцированная экспрессия циклина D1 в клетках поджелудочной железы мышей приводит к выраженной гиперплазии островков лангерганса.

Циклин D1 может индуцировать пролиферацию в -клеток in vivo без образования рака, несмотря на эту выраженную гиперплазию клеток, гипогликемия не наблюдается. Пролиферация, вызванная циклином D1, увеличивает число в -клеток, но не изменяет способность в -клетки реагировать на изменения уровня глюкозы в крови [33]. Комплексы CDK4-циклин D фосфорилируют и частично инактивируют белки ретинобластомы (pRb), p107 и p130, тем самым активируя транскрипционные факторы E2F/DP, модулирующие экспрессию генов, необходимых для запуска клеточного цикла. E2F-чувствительные гены одноименного фактора транскрипции запускают экспрессию циклинов E- и A-типа, которые связывают и активируют CDK2-киназу, фермент, который, как считается, необходим для прохождения через S-фазу [14, 33].

Циклинзависимые киназы D-типа CDK4 и CDK6, экспрессия которых модулируется стимулирующими рост сигналами, функционируют в ранней и средней фазе G1. За ними следует активация CDK2 в комплексе с циклином E в конце G1 фазы. Комплексы CDK2/циклин A функционируют в S-фазе, тогда как комплексы CDK2/циклин B и A способствуют переходу G2/M. CDK2 необходим для завершения профазы митоза, делеция CDK2 влияет на время S-фазы [23].

CDK6, функциональный аналог CDK4, также может образовывать комплексы с D-циклинами, но существует явное полное отсутствие или только минимальная экспрессия CDK 6 в мышиных островках.

Избыточная экспрессия CDK6 в сочетании с циклином D1 заметно увеличивает репликацию в -клеток взрослых людей in vivo. Сверхэкспрессия CDK6 в сочетании с циклин D3 также индуцирует репликацию в -клеток [21].

CDK-6 и циклин D1 in vitro приводили к заметной активации фосфорилирования белка ретинобластомы и запуску процессов пролиферации без индукции гибели клеток. Сверхэкспрессия CDK-6 значительно стимулирует пролиферацию человеческих в-клеток как in vitro, так и in vivo, не вызывая их гибель или потерю функции. С функциональной точки зрения сверхэкспрессия CDK-6 в сочетании с циклином D1 приводит к уникально устойчивой пролиферации. CDK-6 в сочетании с циклином D1 может вызывать еще большую стимуляцию регенерации в-клеток, в некоторых случаях, повышая ее в 40 раз. В отличие от сверхэкспрессии CDK-4, которая сама по себе не способна значительно фосфорилировать pRb, ни активировать деление в-клеток, сверхэкспрессия CDK-6 способна достичь обоих этих результатов, предположительно, в сочетании с эндогенными циклинами D-типа [20].

Генетические и биохимические исследования, проведенные за последние три десятилетия, предоставили существенную информацию о молекулярных механизмах прогрессирования клеточного цикла и показали, что циклинзави-симые киназы являются основными регуляторами этого фундаментального процесса. CDK фосфорилируют многочисленные субстраты, чтобы управлять такими процессами, как репликация ДНК, митоз и цитокинез [24].

Для успешной терапии при сахарном диабете необходимо применение фармакологических субстанций, способствующих повышенной экспрессии циклинзависимых киназ в в -клетках поджелудочной железы, что позволит активизировать процесс их пролиферации и более полно раскрыть потенциал применяемой терапии.