Роль генетического полиморфизма в развитии сепсиса у детей

Сепсис и его последствия по-прежнему являются одной из основных причин заболеваемости и смертности в отделениях интенсивной терапии (ОИТ). Доказательства того, что эндогенные медиаторы на самом деле посредники индивидуальной реакции на инфекцию, привели к появлению различных подходов к оценке влияния генотипа каждого человека на течение заболевания.

Роль генетического фона человека и предрасположенность к выраженности воспалительной реакции определяются изменчивостью генов, которые кодируют эндогенные медиаторы, образующиеся при воспалении. Про- и противовоспалительные медиаторы влияют на восприимчивость и исход у пациентов с системной воспалительной реакцией и сепсисом.

Неоспорим тот факт, что изменение в экспрессии генов имеет важное значение в регуляции физиологической реакции человеческого организма на возбудитель. Изучение связи между генетическим полиморфизмом и сепсисом может предоставить врачам новые инструменты для прогностической оценки, раннего вмешательства и интенсивного лечения лиц с высоким риском и возможности избежать использования терапии с неблагоприятными последствиями для лечения лиц с низким риском. Геномная информация полезна для выявления групп пациентов с высоким риском развития тяжелого сепсиса и полиорганной недостаточности. Определение воздействия генома на течение заболевания позволит не только понять, почему физиологический ответ на операцию варьируется у отдельных лиц, но и уменьшить хирургическую заболеваемость и смертность путем совершенствования предоперационной оценки риска и целенаправленного профилактического лечения пациентов с повышенным хирургическим риском [1]. С целью разработки индивидуализированной терапии важно определить механизм, лежащий в основе патофизиологии сепсиса.

Сепсис является синдромом системной воспалительной реакции, обусловленной инфекцией. Тяжелый сепсис – это сепсис, связанный с полиорганной недостаточностью, гипоперфузией тканей и индуцированной сепсисом гипотонией [2]. Несмотря на огромный прогресс как в знаниях, так и в стратегиях лечения этого синдрома, сепсис остается одной из основных причин заболевания и смертности детей во всем мире. Уровень смертности пациентов, страдающих тяжелым сепсисом, достиг 20–70% [3]. Уход за больным с сепсисом стоит примерно 50 000 долларов на одного пациента, в результате чего только в США экономические последствия достигают почти 17 млрд долларов в год [4].

Как про-, так и противовоспалительные реакции вносят вклад в исход у пациентов с системным воспалением и сепсисом.

Все кодирующие белки гены, участвующие в трансдукции воспалительных процессов, являются генами-кандидатами для определения генетического фона человека, ответственного за межиндивидуальные различия в системной воспалительной реакции на инфекцию. Последние можно определить как гены, наследственные полиморфизмы которых совместимы с жизнью, но в сочетании с неблагоприятными внешними факторами могут послужить причиной различных состояний и заболеваний, в том числе и таких частых патологических, как атеросклероз, сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца и т. д. [5]. Эта группа генов состоит из генов (но не ограничивается ими), ответственных за синтез цитокинов, а также множества других эффекторных молекул, участвующих в воспалительных процессах.

Гены системы свертывания, белки теплового шока или молекулы преобразования сигнала относятся к списку генов-кандидатов для сепсиса, которые вызывают геномные вариации. Освобожденные от иммунокомпетентных клеток цитокины – основные участники воспалительного ответа на инфекцию. Первичные провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкин-1 (IL-1), являются инициаторами высвобождения вторичных про- и противовоспалительных медиаторов, таких как IL-6 и IL-10 [6]. Генетическая вариация этих цитокинов показала, что они играют большую роль в определении восприимчивости и исхода сепсиса.

Сепсис представляет собой чрезвычайно сложный ответ организма на вторжение возбудителя. Однако в доклинических и клинических исследованиях сепсиса в основном рассматривались от одного до нескольких генов и, как правило, фокусировались только на анализе повышенных уровней экспрессии у больных сепсисом в сравнении со здоровыми группами. Развитие высокоскоростного определения последовательности генов позволило установить генетическое воздействие на фенотипы болезней. Развитие технологии микрочипов предоставило беспрецедентную возможность одновременного изучения тысяч генных продуктов с помощью изучения мРНК. В результате данный подход использовали для более точного понимания патобиологии детского септического шока. Технология микрочипов использует чип с твердым носителем (часто стекло или силикон), на котором большое количество (до нескольких тысяч) последовательностей нуклеиновых кислот зафиксированы (иммобилизованы) в заданных, заранее известных местах [7]. Эта технология позволяет изучить генетическое воздействие на последствия сепсиса, а также проанализировать профиль экспрессии генов, которые могут способствовать пониманию патобиологии и патофизиологии сепсиса.

Поскольку восприимчивость к сепсису и терапия пациентов с сепсисом высокогетерогенны, существует вероятность того, что ответ организма на инфекцию частично зависит от наследственных факторов, т.е. генетики.

Опубликованное более 20 лет назад важное исследо- вание Т. Соренсена и его коллег представляет убедительные доказательства связи генетики и восприимчивости к инфекции [8]. Группа из более чем 900 приемных детей, рожденных в период с 1924 по 1926 г., а также их биологические и приемные родители были исследованы на протяжении всего 1982 г. Если биологический родитель умер от инфекции в возрасте до 50 лет, то риск смерти у совершеннолетних усыновленных возрастает в 5,8 раза, что выше, чем в случае всех остальных исследованных причин. Смерть приемного родителя от инфекционных заболеваний не привела к большему относительному риску у приемного ребенка, что позволило исследователям предположить, что существует тесная связь между генетикой и восприимчивостью к инфекции.

Генный полиморфизм определяют как обычное явление (>1%) в популяции из двух или более аллелей в конкретном расположении хромосом. Наиболее часто встречаемый тип полиморфизма называется полиморфизмом единичного нуклеотида (SNP): замена, удаление или внедрение (вставка) одного нуклеотида происходит приблизительно в 1 из 1 000 основных пар ДНК человека. SNP могут привести к абсолютной недостаточности белка, видоизменению белка, изменению уровня нормальной экспрессии белка или к незаметным изменениям функции белка или его экспрессии.

Секвенирование генома человека подчеркнуло, насколько мы похожи как члены вида. Исследование генетических полиморфизмов показало нашу уникальность как индивидов. В течение последних 15 лет примерно 10 млн полиморфизмов обнаружено в человеческом геноме. В некоторых случаях редкие генетические заболевания показаны как результат необычных полиморфизмов в обычно высококонсервативных последовательностях генов. И, наоборот, многие часто встречающиеся нарушения могут быть связаны с обычными полиморфизмами. Существует достаточное количество исследований сепсиса, чтобы предположить, что ответственность за сепсис лежит на обычных полиморфизмах, т.е. неоднородности при проявлении и результатах сепсиса могут быть объяснены одиночными нуклеотидными полиморфизмами.

Сигнальные механизмы, используемые при определении патогена, иммунного ответа и воспаления, и SNP идентифицированы во множестве генов, вовлеченных в эти механизмы. Например, мутации в TLR-4, ключевом рецепторе определения патогена, увеличивают восприимчивость к инфекциям по отношению к грамот-рицательным микроорганизмам [9]. Хотя несколько SNP в TLR-4 описаны, лишь их небольшое количество оказалось связано с повышением риска септического шока и смертности в результате септического шока у детей. Так, замена аденина на гуанин в 896-й паре оснований ведет к началу транскрипции для TLR-4 (+896), что приводит к замене аспарагиновой кислоты глицином в аминокислоте 299 (Asp299Gly). Полиморфизм Asp299Gly связан с пониженной экспрессией и функцией TLR-4 рецептора in vitro. Более того, в ряде исследований взрослые с полиморфизмом Asp299Gly оказались в группе с повышенным риском септического шока и неблагоприятного исхода, в то время как дети с этим полиморфизмом подвержены высокому риску инфекций мочевыводящих путей: у детей этот SNP не влияет ни на восприимчивость, ни на тяжесть септического шока, вызванного менингококками. Эти результаты подтверждены исследованием более 500 детей из Гамбии [10]. SNP, связанные с другими членами совокупности LPS-рецепторов, например D14, MD-2 и MyD88, изучены у взрослых, но до сих пор не изучены у детей. Также исследованы SNP в других классах Toll-like рецепторов. Например, генный полиморфизм TLR-2, основной рецептор, ответственный за распознавание структуры (формы, рисунка) грамположительных бактерий, связан с повышенным риском инфекции как у детей, так и у взрослых. Описано несколько SNP, влияющих на экспрессию цитокинов, однако исследования, связанные с генами у критически больных пациентов с септическим шоком, оказались противоречивыми [11–13].

Одвайр и сотрудники [14] исследовали ассоциацию TNF-α одиночных нуклеотидных полиморфизмов и гаплотипов с экспрессией генов с точки зрения уровня мРНК в группе больных с тяжелым сепсисом. У пациентов, гомозиготных по аллели G в позиции –308, существовала тенденция к продукции большего количества TNF-α мРНК в первый день по сравнению с теми, которые имели аллель А. Статус переносчика для гаплотипа 1 (с А в позиции –863 и G в позиции –308) связан с большим уровнем TNF-α мРНК в 1-й день. Статус переносчика для гаплотипа 4 (с C в позиции –863 и в позиции –308) связан с недостоверным снижением уровня TNF-α мРНК на 1-й день. При прямом сравнении гаплотип 1 связан со значительно более высоким уровнем TNF-α мРНК по сравнению с гаплотипом 4 на 1-й день. Пациенты, гомозиготные по аллели А в позиции –308, чаще страдают тяжелым сепсисом, чем те, которые несут аллель G. Эти выводы подтверждены предыдущими исследованиями, показавшими, что G → АSNP на –308 позиции в TNF-α повышает риск развития тяжелого сепсиса после травмы, ожогов, у пациентов с вне-больничной пневмонией и хирургической инфекцией.

Установлено, что несколько дополнительных полиморфизмов SNP в TNF-β, IL-1, IL-6, IL-8, и IL-10 влияют на восприимчивость и тяжесть септического шока у детей. Существуют генетически опосредованные воздействия на экспрессию многих цитокинов, призванные играть ключевые роли в ответе на сепсис и влияющие на клинические исходы. Нарушение свертывания крови также важно в патогенезе септического шока, и несколько проведенных исследований посвящены изучению полиморфизма ключевых генов, участвующих в коагуляции, повышению восприимчивости и тяжести септического шока у детей с менингококковым септическим шоком. Кроме того, SNP в промотере протеина С связан с восприимчивостью к менингококцемии и тяжестью заболевания у детей.

SNP в генах, участвующих в фагоцитозе, также изучены в контексте септического шока. SNP описаны почти у всех членов семейства Fс γ -рецептора, и несколько из них связаны с восприимчивостью к менингококковому сепсису, тяжестью менингококцемии и неблагоприятным исходом от менингококкового септического шока. Наконец, SNP гена белка bactericidal permeability increasing protein (BPIР) связаны с повышенной смертностью от септического шока у детей [15]. Эти конкретные примеры демонстрируют, как изменения в индивидуальной генетической последовательности могут оказывать большое влияние на экспрессию генов.

Первая публикация, включающая особенности экспрессии генов при детском септическом шоке состояла из исследования 42 детей с септическим шоком, которых сравнивали с 15 здоровыми детьми. Образцы РНК получены из цельной крови, взятой в течение первых 24 часов после поступления в педиатрическое отделение интенсивной терапии с клиникой септического шока. Это сравнение проведено между двумя разными биологическими значениями (т. е. между здоровыми и детьми с клиникой септического шока). Таким образом, продемонстрировано большое количество генов (>2 000), которые дифференциально выражены/подавлены у пациентов с септическим шоком относительно нормальных показателей. Как и ожидалось, регулируемые гены у пациентов с септическим шоком значительно соответствовали генам, отвечающим за иммунитет и воспаление.

Последние открытия этого первоначального изучения профилей экспрессии генов посвящены генам, которые значительно подавлены у пациентов с септическим шоком. Удивительно, но большое количество подавленных генов соответствовало функциональной особенности, связанной с биологией цинка. В результате начальное приближение геномного ответа на детский септический шок охарактеризовали как подавление большинства генов, либо напрямую участвующих в гомеостазе цинка, либо напрямую зависящих от гомеостаза цинка в процессе своего нормального функционирования. В соответствии с этим наблюдением умершие пациенты с септическим шоком имели более низкие уровни цинка в сыворотке по сравнению с выжившими пациентами. Эти выводы породили гипотезу, согласно которой обмен цинка в организме играет определенную роль в патобиологии септического шока и согласуется с уже известными связями между цинком и иммунной функцией. В недавнее время Кноел и его коллеги независимо друг от друга подтвердили эту гипотезу, продемонстрировав, что цинковая недостаточность увеличивает смертность в мышиной модели сепсиса и что добавление цинка частично улучшает прогноз [16]. Второе исследование на основе микрочипов детского септического шока направлено на продольные профили экспрессий генов из образцов РНК 30 детей с септическим шоком, полученных в течение 24 ч после поступления в ОИТ и 48 ч спустя, в срав- нении с 15 нормальными показателями. Один из наиболее значительных сигнальных путей в представленном списке активируемых генов – противовоспалительный цитокин, IL-10 с большим числом генов, устойчиво активируемых у детей с септическим шоком как в первый, так и на третий дни. Это наблюдение предполагает, что патобиология детского септического шока может представлять отказ адаптивной иммунной системы и соответствует недавним экспериментальным и клиническим данным.

Изучение экспрессии всего генома у взрослых с сепсисом и септическим шоком также продемонстрировало широкое распространение и раннее подавление генов, связанных с адаптивной иммунной системой, но наблюдения, касающиеся подавления генов, связанных с биологией цинка, не запротоколированы в ходе исследования взрослых пациентов. Хотя очень заманчиво сделать вывод, что подавление генных функций, связанных с биологией цинка, является уникальной особенностью детского септического шока. Однако это утверждение должно быть проверено путем проведения прямого сравнения данных экспрессии у взрослых и детей, основанных на аналогичных микрочиповых платформах.

Выполнено сравнение профилей экспрессии генов детей с синдромом системного ответа (ССВО), сепсисом и септическим шоком. Эти сравнения позволили идентифицировать образцы экспрессии генов в спектре детского ССВО, сепсиса и септического шока, в частности в отношении регуляции генов, соответствующих врожденному иммунитету. Отмечено несколько значительных образцов экспрессий генов, которые были уникальными и устойчивыми у пациентов с септическим шоком, по отношению к пациентам с ССВО или сепсисом. В частности, пациенты с септическим шоком имели самые явные и устойчивые регуляции генов IL-10. Кроме того, репрессия биологии цинка и генов, связанных с иммунитетом, наиболее заметна и устойчива у пациентов с септическим шоком. Эти данные свидетельствуют о том, что предыдущие наблюдения вокруг биологии цинка и адаптивного иммунитета специфичны для детского септического шока, а не являются общими симптомами критических заболеваний.

Определение экспрессии генов позволяет разделить пациентов на группы высокого и низкого риска при септическом шоке. Септический шок – гетерогенный синдром с вовлечением всех органов и систем организма. Не следует оставлять без внимания биомаркеры, уровень которых можно легко и достаточно быстро выявить в крови больных, и, следовательно, определить возможную стратегию для ранней стратификации пациентов. Например, интерлейкин-8 может быть легко и быстро измерен в образце крови. Установлено, что IL-8 – результирующий биомаркер у детей с септическим шоком. В частности, уровень IL-8, измеренный в течение первых 24 часов после поступления в ОИТ, имеет 95% отрицательное прогнос- тическое значение для смертности. Таким образом, уровень IL-8 в состоянии предсказать выживаемость у детей с септическим шоком при стандартном лечении с 95% вероятностью. Достоверность этого утверждения подкреплена перспективной формальной проверкой в независимой группе, которая демонстрировала идентичное отрицательное прогностическое значение. Аналогичный результат (98% отрицательное прогностическое значение смертности) отмечен при измерении сывороточного уровня хемокинов лиганд 4 (chemokine ligand 4 – CCL4) при поступлении в ОИТ с септическим шоком.

Ответ организма новорожденного и ребенка на вторжение возбудителя – чрезвычайно сложный биологический процесс, находящийся под влиянием как генетических, так и эпигенетических механизмов, которые в конечном счете сказываются на экспрессии генов и влияют на исход течения сепсиса. Продолжение определения генетических полиморфизмов, прогнозирующих неблагоприятные послеоперационные результаты, обеспечивает не только дальнейшее понимание патофизиологических ответов в детской кардиохирургии, но и уменьшает хирургические осложнения и смертность, позволяя врачам эффективнее проводить предоперационную оценку риска и предлагать соответствующую терапию.