Роль гиперпаратиреоза в формировании иммунного статуса при хронической почечной недостаточности (экспериментальное исследование)

Более половины всех случаев летального исхода у больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН) связано c осложнениями инфекционного и воспалительного генеза, последствиями атеросклероза коронарных и церебральных сосудов, развитием сердечной недостаточности [13]. Развитие инфекционных и сердечно-сосудистых осложнений у больных ХПН связывают с вторичной иммунной дисфункцией [6]. В литературе представлены обширные, зачастую противоречивые сведения об изменении иммунного статуса при ХПН. Большинство исследователей сходятся во мнении, что при ХПН наблюдается активация врожденного иммунитета и депрессия адаптивного иммунитета, однако точные механизмы, обеспечивающие такие изменения, не ясны. Ранее нами продемонстрировано участие процессов свободно-радикального окисления и реактантов острой фазы в изменении гомеостаза при почечной недостаточности [1–5]. В качестве возможных патогенетических факторов рассматривают гиперазотемию и накопление продуктов метаболизма в крови, активацию процессов свободно-радикального окисления, нарушение фосфорно-кальциевого обмена, обмена железа, изменение кислотно-основного и водно-электролитного баланса и др. [8, 10, 14]. Гиперпаратиреоз является непременным атрибутом ХПН как результат сложного взаимодействия между содержанием в плазме ионизированного кальция, неорганического фосфора, паратиреоидного гормона (ПТГ), кальцидиола (25(OH)-витамин D), кальцитриола (1,25(OH)2-витамин D), фактора роста фибробластов-23 (FGF-23). Гиперфосфатемия, относительный и абсолютный дефицит кальцитриола, кальцидиола занимают центральное место в патогенезе ГПТ при ХПН и тесно связаны с эффектами ПТГ и FGF-23 [7]. В последние годы объектом пристального внимания многих исследователей являются плейотропные эффекты ПТГ, не связанные с регуляцией минерального обмена, направленные на гемопоэз, регуляцию углеводного и липидного обмена, сосудистого тонуса [11]. Обнаружение рецепторов к ПТГ на иммунокомпетентных клетках предполагает имму-нотропные эффекты данного гормона и возможное участие в патогенезе изменений иммунного статуса при ХПН. Цель работы – исследовать иммунный статус при экспериментальном гиперпаратиреозе и при экспериментальной хронической почечной недостаточности.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 72 белых нелинейных крысах-самцах массой 200–220 г, находящихся в стандартных условиях вивария. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Животные случайным образом разделены на несколько групп: группа 1 – интактные животные (n = 18), группа 2 – ложнооперированные животные (n = 18), группа 3 – животные с ХПН (n = 18), груп па 4 – животные с ГПТ (n = 18). ХПН у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани по методу Б.К. Шуркалина и соавт. ХПН развивалась на 21 сут эксперимента. Для верификации ХПН определяли концентрацию в сыворотке креатинина, мочевины, мочевой кислоты. Группой сравнения при исследовании иммунного статуса при ХПН служили ложнооперированные животные, которым проводили срединную лапаротомию с последующим ушиваем операционной раны. Гиперпаратиреоз у крыс моделировали содержанием на гиперфосфатной диете: в течение 120 дней рацион крыс состоял из синтетической гиперфосфатной смеси

(0,6 % кальция и 4,2 % фосфора). Развитие гиперпаратиреоза верифицировали по увеличению концентрации ПТГ в плазме. Группой сравнения при исследовании иммунного статуса при ГПТ служили интактные животные. Кровь для исследований у всех групп животных забирали пункцией левого желудочка сердца.

В периферической крови общепринятыми методами определяли общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу. Поглотительную способность фагоцитов исследовали с частицами монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистирольного латекса, учитывали активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число. Генерацию активных форм кислорода оценивали в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте с учетом активности (% клеток) и интенсивности (у. е.) и расчетом функционального резерва клеток. Оценку гуморального Th2-зависимого иммунного ответа у крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценку клеточного Th1-зависимого иммунного ответа – по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами. Концентрацию мочевины, мочевой кислоты и креатинина в сыворотке определяли на анализаторе «Analette» (США) с применением тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Для оценки различий между группами применяли критерии Манна–Уитни, Краскела–Уоллиса, Вальда– Вольфовитца, различия считали значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. При экспериментальной ХПН в периферической крови увеличивается количество нейтрофилов за счет сегментоядерных форм и снижается количество лимфоцитов (табл. 1).

Общее количество лейкоцитов значимо не изменяется. При оценке функциональной активности фагоцитов обнаружено увеличение поглотительной способности фагоцитов по показателям активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа (табл. 2).

Кроме того, увеличивается генерация активных форм кислорода фагоцитами по показателям спонтанного и индуцированного НСТ-теста. Однако функциональный резерв

Таблица 1

Количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальной ХПН (M ± m)

Показатель	Группа 1 Л/опериров. (n = 18)	Группа 2 ХПН (n = 18)
Лейкоциты, × 109/л	8,59 ± 0,78	9,13 ± 0,74
Эозинофилы, × 109/л	0,21 ± 0,04	0,19 ± 0,03
Базофилы, × 109/л	0	0
Нейтрофилы п/ядерные, × 109/л	0,29 ± 0,06	0,34 ± 0,05
Нейтрофилы с/ядерные, × 109/л	3,19 ± 0,35	5,17 ± 0,46*
Нейтрофилы всего, × 109/л	3,49 ± 0,39	5,51 ± 0,49*
Лимфоциты, × 109/л	4,27 ± 0,41	2,64 ± 0,20*
Моноциты, × 109/л	0,62 ± 0,12	0,80 ± 0,13

Примечание. Здесь и в табл. 2 *– статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 1.

Таблица 2

Показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной ХПН (M ± m)

Показатель Группа 1 Л/опериров. (n = 18) Группа 2 ХПН (n = 18) Активность фагоцитоза, % 32,37 ± 2,01 45,20 ± 3,05 * Интенсивность фагоцитоза, у. е. 0,65 ± 0,05 1,25 ± 0,20 * Фагоцитарное число, у. е. 2,21 ± 0,09 3,60 ± 0,29 * НСТ-тест спонт., активность, % 8,67 ± 1,69 18,00 ± 2,29 * НСТ-тест спонт., интенсивность, у. е. 0,14 ± 0,03 0,29 ± 0,05 * НСТ-тест инд., активность, % 15,05 ± 2,79 20,36 ± 1,83 НСТ-тест инд., интенсивность, у. е. 0,19 ± 0,04 0,28 ± 0,03 * Функц. резерв (активность НСТ-теста) 1,74 ± 0,08 1,13 ± 0,06 * Функц. резерв (интенсивность НСТ-теста) 1,36 ± 0,04 0,97 ± 0,05 * ГЗТ 0,48 ± 0,07 0,26 ± 0,04 * ЯСК, 106 ЯСК 597,06 ± 140,28 257,17 ± 59,54 * ЯСК, 104 536,07 ± 177,32 154,16 ± 65,65 * фагоцитов, оцениваемый по активности интенсивности НСТ-теста, значимо снижается при сравнении с контрольной группой животных. При экспериментальной ХПН снижается интенсивность реакции ГЗТ и количество АОК в селезенке крыс, что свидетельствует об угнетении Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа соответственно.

Ранее нами показано, что при ХПН возрастает гибель лимфоцитов в крови путем некроза и апоптоза, индуктором которой могут выступать различные вещества, накапливающиеся в крови, например, индоламин-2,3-диоксигеназа и аргиназа I типа, участвующие в катаболизме соответственно триптофана и аргинина. Установлены проапоптотическое и антипролиферативное действие индолами-на-2,3-диоксигеназы и аргиназы I типа на Т-клетки, их концентрация в крови обратно пропорциональна абсолютному количеству лимфоцитов. Патогенез активации функциональной активности фагоцитов при ХПН является многофакторным: имеют значение азо темия, нарушение обмена витамина D, гиперпаратиреоз и сопутствующее нарушение фос-форно-кальциевого обмена, нарушение обмена железа, анемия, активация РААС, гемодиализная процедура и другие факторы [6].

Установлено, что при экспериментальном гиперпаратиреозе в периферической крови снижается количество лейкоцитов, абсолютное количество лимфоцитов (табл. 3).

Общее количество лейкоцитов не выходит за пределы допустимых референсных значений. Отмечено усиление функциональной активности фагоцитов в периферической крови по способности клеток захватывать частицы латекса и генерации ими активных форм кислорода (табл. 4).

Интенсивность фагоцитоза возрастает на 28 %, фагоцитарное число – на 118 %, интенсивность спонтанного НСТ-теста – на 86 %, интенсивность индуцированного НСТ-теста – на 84 %. На 45 % возрастает функциональный резерв фагоцитов в крови, оцениваемый по активности НСТ-теста. Интенсивность реак-

Таблица 3

Количественный состав лейкоцитов в периферической крови при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)

Показатель	Группа 3 Интактные (n = 18)	Группа 4 ГПТ (n = 18)
Лейкоциты, × 109/л	8,34 ± 0,98	6,84 ± 1,09 *
Эозинофилы, × 109/л	0,11 ± 0,14	0,17 ± 0,03
Базофилы, × 109/л	0	0,02 ± 0,02
Нейтрофилы п/ядерные, × 109/л	0,27 ± 0,06	0,40 ± 0,06
Нейтрофилы с/ядерные, × 109/л	3,06 ± 0,39	3,24 ± 0,25
Нейтрофилы всего, × 109/л	3,33 ± 0,14	3,64 ± 0,30
Лимфоциты, × 109/л	4,16 ± 0,49	2,59 ± 0,36 *
Моноциты, × 109/л	0,75 ± 0,16	0,41 ± 0,08

Примечание. Здесь и в табл. 4 *– статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 3.

Таблица 4

Показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальном гиперпаратиреозе (M ± m)

Показатель Группа 3 Интактные (n = 18) Группа 4 ГПТ (n = 18) Активность фагоцитоза, % 31,23 ± 2,76 29,00 ± 1,75 Интенсивность фагоцитоза, у. е. 0,69 ± 0,07 0,83 ± 0,09* Фагоцитарное число, у. е. 2,23 ± 0,13 4,81 ± 0,59* НСТ-тест спонт., активность, % 8,00 ± 2,46 7,67 ± 0,49 НСТ-тест спонт., интенсивность, у. е. 0,17 ± 0,04 0,26 ± 0,13* НСТ-тест инд., активность, % 18,90 ± 4,21 19,33 ± 0,61 НСТ-тест инд., интенсивность, у. е. 0,20 ± 0,08 0,35 ± 0,11* Функц. резерв (активность НСТ-теста) 2,36 ± 0,06 2,52 ± 0,05* Функц. резерв (интенсивность НСТ-теста) 1,18 ± 0,07 1,35 ± 0,05 ГЗТ 0,36 ± 0,03 0,27 ± 0,05* ЯСК, 106 ЯСК 192,19 ± 24,69 137,40 ± 31,39* ЯСК, 104 125,33 ± 33,50 57,90 ± 13,71* ции ГЗТ, косвенно отражающая интенсивность Th1-зависимого иммунного ответа, снижается на 25 %. Количество антителообразующих клеток в селезенке снижается как в абсолютных величинах (на 54 %), так и в пересчете на 106 ядросодержащих клеток (ЯСК) (на 29 %), что демонстрирует угнетение Th2-зависимого иммунного ответа. Полагаем, что депрессия показателей адаптивного иммунитета в определенной мере обусловлена лим-фоцитопенией. При проведении корреляционного анализа нами установлена прямая средней силы статистически значимая связь между количеством лимфоцитов в периферической крови и абсолютным количеством АОК в селезенке (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,62; p < 0,05).

По данным литературы, ПТГ оказывает прямое и опосредованное влияние на иммунокомпетентные клетки и формирование иммунного статуса при ГПТ. Рецепторы к ПТГ обнаружены на гранулоцитах и лимфоцитах периферической крови [12]. Активация фагоцитов при гиперпаратиреозе может быть связана с изменением цитокинового профиля в крови, в частности, повышением концентрации ИЛ-6, ТНФ-альфа [9]. Одним из ключевых механизмов дисфункции фагоцитов при ГПТ может быть повышение внутриклеточной концентрации Ca2+ и сопутствующие изменения активности внутриклеточных мессенджеров (аденилатциклазы), интенсивности углеводного обмена, захвата и утилизации кислорода и др. факторы.

Выводы

• 1.    При экспериментальной ХПН в периферической крови наблюдается нейтрофилия и лимфоцитопения, активируется поглотительная способность и генерация активных форм кислорода фагоцитов периферической крови, зафиксирована депрессия Th1- и Th2-зависимого адаптивного иммунного ответа.

• 2.    При диета-индуцированном экспериментальном гиперпаратиреозе у крыс снижается количество лимфоцитов в периферической крови, увеличивается поглотительная способность и генерация кислородных радикалов фагоцитами периферической крови, снижается выраженность Th1- и Th2-зави-симого иммунного ответа. Угнетение Th2-зависимого иммунного ответа прогрессирует по мере снижения количества лимфоцитов в крови.

• 3.    Однонаправленные изменения иммунного статуса при ХПН и гиперпаратиреозе предполагают участие ПТГ в патогенезе вторичной иммунной дисфункции при ХПН.