Роль хорионического гонадотропина в дифференцировке интерлейкин-17-продуцирующих Т-лимфоцитов-хелперов (TH17)

Хорионический гонадотропин (ХГ) – ключевой гормон беременности, активно участвующий в контроле иммунных процессов, сопровождающих гестацию. Однако регуляция активности относительно недавно открытой субпопуляции интерлейкин (IL)-17–продуцирующих лимфоцитов (Th17) со стороны ХГ практически не изучена.

Субпопуляция Th17 была впервые описана в 2005 г. L.E. Harrington и H. Park [Harrington et al., 2005; Park et al., 2005], которые независимо друг от друга опубликовали данные о том, что наивные Т-хелперы (Th) могут дифференцироваться в IL-17–продуциру-ющие клетки, образуя отдельную популяцию лимфоцитов. Клетка-предшественник может дифференцироваться в Th1, Th2, Т-регуляторные лимфоциты (Treg) и Th17 в зависимости от цитокиновых сигналов и до окончательной дифференцировки субпопуляции обладает пластичностью. В процессе формирования Th17 клетка-предшественник дифференцируется в Th17/Treg-интермедиаторную клетку, которая экспрессирует как мастер-регулятор Th17 – RORyt, так и мастер-регулятор T-регуляторных лимфоцитов – FOXP3 (forkhead box P3). Дальнейшая дифференцировка регулируется трансформирующим фактором роста - (TGF- — когда дендритная клетка активирована микроорганизмами, она продуцирует

IL-1—и IL-6, в этом случае сочетание TGF-—-и IL-1-+IL-6 индуцируют дифференцировку по Th17 типу [Saito et al., 2010].

Основным транскрипционным фактором Th17 является RORyt (RORC2) (retinoid orphan nuclear receptor). Важную роль в развитии уже дифференцированных Th17 играет IL-23 и IL-21, в то время как TGF- —-в высоких концентрациях ингибирует развитие Th17. Однако в низких дозах, а также совместно с IL-6, TGF-- индуцирует дифференцировку наивных Т-клеток периферической крови в Th17 [Кетлинский, 2009]. Помимо этого, важным фактором дифференцировки этих клеток является IL-1β, который может усиливать действие IL-6 и IL-23. Из этих факторов складывается стимул для дифференцировки наивных Т-лимфоцитов в Th17. IL-4 и интерферон- °(IFN- *) способны ингибировать развитие Th17, но IL-17 не ингибирует дифференцировку Th1/Th2 [Кетлинский, 2009]. IL-17 (A и F), являясь основным цитокином Th17, вызывает синтез IL-1, IL-6, IL-8 и ряда других воспалительных факторов [Кологривова Кологривова, Суслова, 2011]. Так, IL-17 участвует в развитии аутоиммунных заболеваний и остром отторжении трансплантата. Известно, что IL-17 играет важную роль в патофизиологии ревматоидного артрита [Xie, Wang, Li, 2012], в то время как во время беременности симптомы этого заболевания становятся менее выраженными.

У здоровых людей в периферической крови уровень Th17-клеток составляет 0.64–1.4%. Уровень этих клеток в период беременности сопоставим с таковым у небеременных женщин, но есть данные о том, что в III триместре он ниже [Santner-Nanan et al., 2009]. Однако количество этих клеток в децидуальной оболочке выше, чем на периферии. Вероятно, это связано с необходимым усилением противо-микробного иммунитета.

Нормальная беременность сопровождается снижением Th17 в периферической крови в сравнении с небеременными женщинами [Santner-Nanan et al., 2009]. Повышение уровня Th17 может вести к преждевременным родам или спонтанному аборту [Saito et al., 2010]. Однако повышение IL-17 является следствием гибели плода во время прерывания беременности, но не причиной гибели. В частности, хроническое воспаление ведет к аборту с повышением уровня провоспалительных цитокинов, что влечет за собой изменение баланса между Treg/Th17.

Цель работы – изучение влияния ХГ на тимический и посттимический этапы дифференцировки Th17.

Материалы и методы

ХГ («Profasi», Италия) применяли в концентрациях 10 и 100 МЕ/мл (II-III и I триместр беременности, соответственно). Тимический этап изучали на тимоцитах (CD4⁺CD8⁺) детей до 1 года, выделенных из фрагментов тимуса, удаляемых в ходе сердечнососудистых операций. Посттимический этап изучали на выделенных методом магнитной селекции периферических СD4⁺-лимфоцитах небеременных женщин. Культуры клеток инкубировали с ХГ в полной питательной среде в течение 72 ч. при 37^С в условиях 5% СО 2 , в присутствии стандартных индукторов Th17 (IL-1β (10 нг/мл, «eBioscience», США) и IL-6 (10 нг/мл, «eBioscience», США) [Acosta-Rodrigiez et al., 2007], магнитные частицы с анти-CD3/CD28 моноклональными антителами (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen», США), и нейтрализующие анти-ИФН- ° и анти-ИЛ-4 антитела (10 мкг/мл, «eBioscience», США). Число Th17 оценивали как процент CD4⁺-лимфоцитов, экспрессирующих ROR- ° и IL-17A в гейте CD4⁺-клеток, кроме этого на тимоцитах оценивали экспрессию CD161 (все антитела «eBioscience», США).

Для индукции дифференцировки Th17 из CD4-позитивных Т-лимфоцитов в культуры вносили аналогичные индукторы. После 72 ч. инкубации оценивали количество Th17 как процент CD4+-лимфоци-тов (FITC Anti-Human CD4) («eBioscience», США), экспрессирующих транскрипционный фактор ROR-° (Anti-Mouse/Human ROR-gamma-t-PE), ИЛ-17 (Anti-Human IL17A-PerCP-Cy5.5) («eBioscience», США). В ряде экспериментов количество Th17 также определяли по экспрессии хемокинового рецептора CCR6 CD4+IL17A+(CD196; CCR6-PE)

(«eBioscience», США), поскольку Th17 постоянно экспрессируют этот рецептор [Annunziato et al. 2008]. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). В супернатантах культур параллельно оценивали уровень ИЛ-17 иммуноферментным методом про помощи набора («eBioscience», США).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t -критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

При изучении влияния ХГ на индукцию Th17 в культурах IL-1 β - и IL-6-примированных тимоцитов установлено, что гормон в низкой концентрации увеличивал количество CD4⁺IL-17A⁺-тимоцитов в культуре, в то время как в высокой концентрации ХГ не оказывал подобного эффекта. Аналогично не выявлено влияния ХГ на уровень CD4 + ROR- ° +, CD4⁺CD161⁺, а также CD4⁺CD161⁺IL-17A⁺ в культуре (рис. 1). Таким образом, ХГ стимулирует экспрессию IL17A в CD4-позитивных тимоцитах, этот эффект проявляется только при использовании низкой концентрации гормона. По-видимому, из-за того, что тимоциты характеризуются низкой экспрессией рецепторов для ХГ [Su et al., 2013] отсутствие эффекта высокой концентрации гормона, наблюдаемой в I триместре, объясняется десенситиза-цией его рецепторов, что делает возможным реализацию эффектов ХГ только в низкой концентрации.

Рис. 1 . Влияние ХГ на тимический этап дифференцировки Th17 (n=7):

• а) CD4⁺IL17A⁺-тимоциты; б) CD4 + ROR t ⁴-тимоциты; в) CD4⁺CD161⁺IL17A⁺-тимоциты; здесь и далее * – достоверные (p<0.05) по t-критерию Стьюдента различия с контролем

В отношении посттимического этапа дифференцировки Th17 показано, что ХГ снижал количество CD4+-лимфоцитов, экспрессирующих ROR- *t (рис. 2). Кроме того, ХГ достоверно снижал уровень дубль-позитивных ROR- <+1Ъ-17А+-лимфоцитов. Оценка уровня IL-17A в супернатантах фракционированных CD4+-клетках подтвердила угнетающий эффект ХГ на процессы дифференцировки Th в Th17 на уровне периферических Т-лимфоцитов (рис. 2г). Кроме этого, нами показано, что гормон достоверно снижает экспрессию хемокинового рецептора CCR6, необходимого для направленной миграции Th17 в очаг воспаления (рис. 2в).

Рис. 2. Влияние ХГ на посттимический этап дифференцировки Th17 (n=7):

а) CD4⁺IL17A⁺-лимфоциты; б) CD4 + ROR 1 ⁺-лимфоциты; в) CD4⁺CCR6⁺IL17A⁺-лимфоциты; г) уровень IL-17A в супернатантах культур

Важно отметить, что ХГ реализует Th17-угне-тающий эффект вне зависимости от концентраций т.е. на протяжении всего периода протекающей беременности. Таким образом, ХГ препятствует не только дифференцировке Th0 в Th17, но и угнетает их функциональную активность. С учетом того факта, что ХГ индуцирует экспрессию молекулы FOXP3 [Заморина, Ширшев, 2013], содержащей домен (кодируемый экзоном 2), ответственный за непосредственное связывание транскрипционных факторов семейства ROR [Ichiyama et al., 2008] можно предположить, что это создает условия для поляризации CD4+ T-клеток в Treg, одновременно блокируя процессы дифференцировки в Th17.

Таким образом, ХГ практически не влияет на тимический этап дифференцировки Th17 и угнетает функциональную активность данных эффекторов на уровне периферических лимфоцитов.

Вероятно, продемонстрированное нами на уровне периферических Т-лимфоцитов ХГ-зависи-мое угнетение Th17 способно предотвращать анти-фетальные реакции, тем самым участвуя в поддержании иммунной толерантности при беременности.

Работа поддержана программой Президиума РАН МКБ, 12-П-4-1017.