Роль хронического экспериментального поражения печени матери в нарушении генеративной функции потомства

Одной из важнейших причин перинатальной патологии являются экстрагенитальные заболевания женщин, в структуре которых особое место, в силу своей распространенности, занимают болезни гепатобилиарной системы [9].

Ранее нами было показано, что у самок крыс с хроническим экспериментальным поражением гепатобилиарной системы имеет место задержка наступления беременности, пролонгирование беременности до 28–29 дней. При этом наблюдалось снижение численности пометов, характеризующихся выраженными признаками физиологической незрелости [2], что проявляется нарушением морфофункционального становления систем жизнеобеспечения, в том числе иммунной, кроветворной, пищеварительной, нейроэндокринной [1].

Эти теоретические предпосылки явились причиной изучения особенностей становления генеративной функции у 60-дневного потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы различного генеза.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на белых лабораторных крысах «Вис-тар» (30 взрослых половозрелых самок) и их 60-дневом потомстве (60 крысят из 31 помета). Для достижения поставленной цели у взрослых половозрелых крыс-самок моделировалось хроническое поражение печени токсической и аутоиммунной этиологии.

Хроническое токсическое поражение («токсическая» – «Т»-группа) печени вызывалось путем однократного внутрибрюшинного введения взрослым половозрелым крысам Д (+)-галактозамина гидрохлорида («Sigma – G500», США) на 0,9 %-ном растворе натрия хлорида в дозе 250 мг/кг массы тела животного [3]. Экспериментальную «галактозаминовую» группу («Г»-группу) составили 20 крысят из 10 пометов.

Вторую группу составили животные, у которых создавался аутоиммунный процесс с преимущественным поражением печени («аутоиммунная» – «А»-группа) путем введения им 0,2 мл супернатанта шестидневной культуры E.coli (штамм АТСС 25922) [6]. Эту экспериментальную группу («Е»-группу) составили 17 крысят из 9 пометов.

О развитии патологического процесса в печени экспериментальных животных судили на основании морфологических изменений (очаговые бионекротические изменения гепатоцитов, дис-комплексация гепатоцитов, периваскулярная лим-фогистиоцитарная инфильтрация, гипертрофия и гиперплазия купферовских клеток), биохимических критериев (повышение концентрации билирубина, аланин- и аспартатаминотрансфераз и др.) и высокого титра печеночных аутоантител (1:640 и 1:1280).

Контрольную группу («К»-группа) составили интактные животные (23 крысенка из 12 пометов).

Объектом исследования явилось непосредственно потомство самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы на 60-й день после рождения, у которого проводилась оценка генеративной функции. Прежде всего осуществлялось определение весового индекса муж- ских и женских половых желез. Оценка генеративной функции семенников проводилась на серийных гистологических срезах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну по общепринятой методике [8] с определением площади семенных извитых канальцев, суммарного количества сперматогенных клеток и их субпопуляционного состава, а также количества канальцев со слущенным эпителием и числа гигантских сперма-тогенных клеток.

Одним из показателей, отражающих фертильность сперматозоидов, является характер их подвижности. В связи с этим нами проводилась оценка подвижности эпидидимальных сперматозоидов по общепринятой методике с определением числа неподвижных (0 баллов), «дергающихся» на месте (1 балл), слабоподвижных (2 балла) и прогрессивно-подвижных (3 балла) сперматозоидов. Для постановки этого теста зрелые сперматозоиды получали из придатка семенника [5]. Затем с использованием камеры Горяева в полученной взвеси подсчитывали сперматозоиды в 5 больших квадратах в течение трех часов через каждые 15 минут.

Для оценки фолликулогенеза в яичниках потомства экспериментальных животных на серийных гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, а также железным гепаток-силином, проводился морфометрический анализ, позволяющий произвести дифференцированный подсчет овариальных фолликулов разных пулов. При этом использовалась общепринятая классификация Lintern Moore (1967), по методике Pedesen a Peters [10], основанная на оценке фолликула с определенным количеством фолликулярных клеток и его диаметра. Во избежание ошибок и повторов при подсчете учитывались овариальные фолликулы на максимальных сечениях ооцитов, маркерами которых служили ядрышки. Фолликулы, имеющие в окружении менее 10 клеток, относили к стадии 1–2 (покоящиеся); 1–20 клеток – к стадии 3а; 21–60 клеток – к стадии 3б; 61–100 клеток – к стадии 4; от 101 до 200 клеток – к стадии 5а; 201–400 клеток – к стадии 5б (растущие); 401–

600 клеток – к стадии 6; больше 600 – к стадии 7–8 (полостные). Для активности атрезии подсчитывали общее количество атретических фолликулов.

Полученные результаты обработаны статистически с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6,0». Достоверность результатов оценивалась с помощью непараметрического критерии Манна–Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение. Площадь поперечного сечения и диаметр семенных извитых канальцев оказались сниженными по сравнению с таковым в контроле. Так, если у интактных 60-дневных крысят диаметр семенных канальцев составил 234,47 ± 5,527, то у подопытных животных токсической и аутоиммунной групп исследуемый показатель составил всего 189,13 ± 5,196 и 198,78 ± 4,69 соответственно. Аналогичная закономерность выявлена и при изучении площади поперечного сечения канальцев. Так, у интактных крысят данный показатель составил 43574 ± 1592 мкм², а у подопытных крысят всего 28387 ± 1005 мкм² и 31298 ± 584 мкм² соответственно.

Важнейшим показателем структурно-функционального состояния семенника является характеристика сперматогенного пласта. Сперматоген-ный пласт изучался нами с учетом суммарного содержания сперматогенных клеток и их субпопуляционного состава. Обнаружено, что у интактных крысят суммарное содержание сперматогенных клеток составляет 265,9 ± 33,53, а у подопытных животных как токсической (235,21 ± 3,29), так и аутоиммунной (242,15 ± 2,63) групп снижено.

Наибольший интерес представляют данные дифференцированного анализа сперматогенных клеток с учетом их зрелости [8].

Нами установлено, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени имеет место изменение субпопуляционного состава сперматогенных клеток по сравнению с контролем (табл. 1).

Как видно из табл. 1, какой-либо закономерности в изменении числа сперматогоний различной степени зрелости (А, П, Б) у эксперименталь-

Таблица 1

Субпопуляционный состав сперматогенных клеток семенных извитых канальцев семенников экспериментальных животных (M ± m)

Сперматогенные клетки	Группа
	Контрольная (К)	Опытная 1 (О1)	Опытная 2 (О2)
Суммарное содержание сперматогоний	44,94 ± 0,86	13,36 ± 0,66*	46,12 ± 3,00
Сперматогонии А	22,38 ± 0,18	20,65 ± 0,31*	20,72 ± 0,11*
Сперматогонии П	8,87 ± 0,18	9,08 ± 0,4*	9,75 ± 0,22*
Сперматогонии Б	13,69 ± 0,3	13,63 ± 0,33*	12,28 ± 0,49*
Сперматоциты I и II	194,57 ± 1,87	179,3 ± 2,5*	179,79 ± 1,56*
Сперматиды	16,46 ± 1,19	8,61 ± 0,5*	10,59 ± 0,79*
Сперматозоиды	9,94 ± 0,86	3,93 ± 0,49*	6,53 ± 0,92*
Суммарное кол-во сперматогенных клеток	265,9 ± 3,52	235,21 ± 3,2*	242,15 ± 2,6*

Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05).

Проблемы здравоохранения

ных животных выявить не удается. В то же время содержание сперматоцитов 1 и 2 порядка, сперматид и сперматозоидов в семенных извитых канальцах подопытных крысят снижено по сравнению с интактными животными. Вместе с тем у подопытных крысят выявлено существенное увеличение по сравнению с контрольной группой числа семенных извитых канальцев со слущенным эпителием, являющегося чувствительным индикатором интенсивности апоптотических процессов. Так, если у интактных крысят содержание канальцев со слущенным эпителием составляет 7,11 ± 1,3, то у подопытных животных обеих групп исследуемый показатель оказался существенно увеличенным и составил 25,5 ± 3,1 и 27,44 ± 4,0. Заслуживают внимания также данные, свидетельствующие об увеличении в семенных извитых канальцах подопытных крысят числа гигантских сперматогенных клеток. Так у интактных крысят содержание таких клеток в канальцах составило 0,32 ± 0,02, а у подопытных животных обеих экспериментальных групп этот показатель оказался равным 0,64 ± 0,13 и 0,55 ± 0,08.

Таким образом, анализ результатов данной серии исследования позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы имеет место нарушение процесса сперматогенеза, о чем свидетельствует, прежде всего, снижение суммарного содержания сперматогенных клеток, а также количества сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов в семенных извитых канальцах.

Анализ двигательной активности сперматозоидов позволил выявить следующую закономерность . У подопытных половозрелых крысят общее содержание в 1 мл эпидидимальных сперматозоидов снижено по сравнению с контролем (154,47 ± 2,74)·106 и составляет соответственно (69,24 ± 1,365)·106 и (99,29 ± 1,716)·106. Кроме того, у интактных крысят первоначально содержание прогрессивно-подвижных сперматозоидов составило 18,90 ± 0,691 %, в то время как у крысят опытной группы 1 этот показатель был равен всего 8,25 ± 1,876 %, а у животных второй опытной группы 1,86 ± 1,742 %. Через 15 минут после начала исследования у подопытных крысят отсутствовали прогрессивноподвижные сперматозоиды, в то же время у интактных животных число половых клеток данной популяции составило 0,25 ± 0,125 %. Аналогичная закономерность выявлена и при анализе содержания слабоподвижных сперматозоидов (рис. 1).

Таким образом, на всех сроках исследования у подопытных крысят обеих групп число фертильных сперматозоидов (прогрессивно-подвижных и слабоподвижных) снижено по сравнению с контролем.

При этом у подопытных крысят обеих групп содержание нефертильных («дергающихся» на месте и неподвижных) сперматозоидов на большинстве сроков исследования оказалось повышенным по сравнению с группой сравнения (рис. 2).

В следующей серии нашего исследования проведен анализ особенностей фолликулогенеза в яичниках потомства самок крыс с эксперимен-

Рис . 1. Динамика изменения содержания эпидидимальных слабоподвижных сперматозоидов

а)

б)

Рис. 2. Динамика изменения содержания эпидидимальных «дёргающихся» (а) и неподвижных (б) сперматозоидов

Таблица 2

Популяционный состав фолликулов по степени зрелости в яичниках экспериментальных животных (M ± m)

Показатель	Группа
	К	О1	О2
Суммар. кол-во фоллик.	702 ± 53	526 ± 34	627 ± 58*
Фолликулы 1 типа	164 ± 28	80 ± 4	138 ± 22*
Фолликулы 2 - 3 а типа	90 ± 11	47 ± 6*	58 ± 6*
Фолликулы 3 б типа	64 ± 5	40 ± 4	76 ± 7*
Фолликулы 4 типа	62 ± 6	74 ± 6*	85 ± 5
Фолликулы 5 а типа	96 ± 9	54 ± 3*	52 ± 6*
Фолликулы 5 б типа	112 ± 16	107 ± 8	98 ± 6
Фолликулы 6 типа	42 ± 3	40 ± 5*	54 ± 6
Фолликулы 7– 8 типа	96 ± 9	84 ± 7*	66 ± 5
Малые фолликулы	254 ± 25	127 ± 27	196 ± 46*
Средние фолликулы	222 ± 16	168±15	213 ± 14*
Большие фолликулы	226 ± 19	231 ± 24	218 ± 19

Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05).

тальным поражением печени (табл. 2). Одним их важнейших показателей, отражающих функциональное состояние яичников, является суммарное содержание фолликулов различной степени зрелости [4]. Нами установлено, что у подопытных животных суммарное содержание фолликулов снижено по сравнению с контролем.

Так, у интактных крысят этот показатель составил 702 ± 53, в то время как у подопытных животных и токсической (526 ± 34), так и аутоиммунной (627 ± 58) групп суммарное содержание фолликулов различной степени зрелости оказалось сниженным. При этом дифференцированный подсчет овариальных фолликулов позволил выявить определенную закономерность: у подопытных крысят содержание больших фолликулов практически не отличается от контроля, в то время как число малых фолликулов, являющихся резервом будущих половых клеток, существенно снижено (см. табл. 2). Уменьшение числа растущих фолликулов в яичниках подопытных крысят обеих групп в период становления половой зрелости согласуется с результатами, полученными при анализе числа атретических фолликулов в их яичниках. У потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза число атрети-ческих фолликулов существенно увеличено по сравнению с контролем. Так, у подопытных животных токсической и аутоиммунной групп число атретических фолликулов соответственно составило 39,54 и 31,67 %, в то время как у животных контрольной группы исследуемый показатель оказался равным 30,7 %.

Таким образом, результаты данной серии исследования позволяют констатировать, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени, в яичниках имеет место нарушение процесса фолликулогенеза, что, прежде всего, находит свое проявление в уменьшении числа рас- тущих фолликулов и как следствие уменьшение суммарного количества фолликулов, а также в усилении процессов атрезии фолликулов.

Заключение . Нарушение условий внутриутробного развития при моделировании поражения гепатобилиарной системы матери приводит к нарушению процессов формирования коррелятивных взаимоотношений в гипофизарно-тиреоидно-адреналово-половой системе плода, что обусловливает задержку структурного становления репродуктивной системы. Развивающийся комплекс изменений репродуктивной системы потомства может возникнуть в результате массированного проникновения через фетоплацентарный барьер патологических продуктов метаболизма при токсической патологии печени, а также сенсибилизированных цитотоксических Т-лимфоцитов, специфических антител, циркулирующих иммунных комплексов и других гуморальных факторов иммунной системы, что наиболее характерно для аутоиммунного поражения печени. Под влиянием этих факторов происходит нарушение процессов мейоза, усиление дегенеративной гибели половых клеток и уменьшение их суммарного количества. В целом, выявленные нарушения процессов сперматогенеза и фолликулогенеза позволяют говорить, что у самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы рождается потомство с нарушением становления репродуктивной функции.