Роль иммунных протеасом в механизмах лимфогенного метастазирования при немелкоклеточном раке легкого

По данным мировой статистики, новообразования легких являются ведущей причиной заболеваемости и смертности населения [1, 2]. Согласно классификации ВОЗ, опухоли легких разделяют на две большие категории: немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), составляющий 80–85 % всех случаев рака легких, и мелкоклеточный рак легкого (МРЛ), представляющий остальные 15 % случаев. Немелкоклеточный рак легкого может быть представлен такими морфологическими подтипами, как аденокарцинома, плоскоклеточный рак и крупноклеточный рак [3, 4]. Употребление табака является основным фактором риска развития рака легких во всем мире, однако промышленные канцерогены, радон, загрязнение воздуха, которые могут существенно различаться в зависимости от страны, также способствуют заболеваемости и смертности от рака легких [3, 5]. Что касается данных о структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России, то рак легкого занимает 2-е место среди мужского населения и 10-е место – среди женского. Структура смертности от злокачественных новообразований мужского и женского населения имеет существенные различия. 1/4 (25,1 %) случаев смерти мужчин обусловлены раком трахеи, бронхов, легкого, смертность женского населения от рака легкого составляет 7,3 % [6].

Рак легких часто диагностируют на поздних стадиях злокачественного процесса, что делает таргетную терапию чрезвычайно сложной, а системную терапию менее эффективной [7], поэтому основной причиной летальности при НМРЛ является метастазирование во внелегочные органы, такие как мозг, кости, печень и надпочечники [8]. Выживаемость при метастатическом НМРЛ невелика (5-летняя выживаемость составляет всего около 4 %) [9]. В настоящее время достаточно хорошо изучен механизм развития гематогенных метастазов при НМРЛ, показана важная роль ангиогенеза, иммунной системы, гипоксии и подвижности опухолевых клеток в метастазировании рака легкого [7, 10]. Как правило, большинство злокачественных опухолей первоначально распространяется через лимфатическую систему с последующим гематогенным метастазированием [11]. При НМРЛ метастазы в лимфатические узлы (ЛУ) являются первичным и важным путем метастазирования [12].

Убиквитин-протеасомная система (УПС) ответственна за деградацию более 80 % выполнивших свою функцию, короткоживущих и поврежденных белков. Поскольку УПС участвует в регуляции множества функций, нарушение которых может стать критичным для организма человека, дисфункция системы приводит к различным заболеваниям, в том числе и к развитию опухолевых процессов [13]. Конститутивные протеасомы, содержащие протеолитические субъединицы β1, β2 и β5, участвуют, как правило, в белковом обмене, в то время как иммунные протеасомы с протеолитическими субъединицами LMP2, LMP10, LMP7 обеспечивают в основном регуляторные процессы [14]. Показана важная роль УПС в механизмах опухолевого прогрессирования, который может быть обусловлен участием в деградации многих регуляторов и эффекторов этих процессов [15]. Несмотря на то, что большинство видов рака человека первоначально метастазируют через лимфатическую систему, механизмы лимфогенного метастазирования остаются недостаточно изученными [16]. Понимание механизма опухолеассоциированного лимфангиогенеза имеет большое значение для прогноза и определения терапевтической стратегии у пациентов с лимфатическими метастазами НМРЛ.

Молекулярные механизмы лимфогенного метастазирования при раке легкого

При отсутствии выявляемых гематогенных метастазов определяющей для выбора лечебной тактики и уточнения прогноза является степень регионарного лимфогенного распространения рака легкого [17]. Наличие метастазов в сторожевых лимфатических узлах онкологических больных используется в качестве основы для установления стадии опухолевого процесса, прогнозирования течения заболевания и разработки стратегий лечения [18]. Фактически биопсия сторожевого ЛУ часто выявляет распространение метастазов до того, как они будут обнаружены традиционными методами визуализации, такими как позитронноэмиссионная томография/компьютерная томография. Сложная роль лимфатической системы в метастазировании еще не до конца понята, однако очевидно, что лучшее понимание взаимодействия между опухолевыми клетками, их микроокружением и лимфатической системой во время метастазирования жизненно важно для открытия новых методов лечения.

В настоящее время выявлена связь возникновения локорегионарных рецидивов, включая метахронные метастазы в грудные лимфатические узлы и рецидив в культю бронхов, с наличием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии [19]. В эксперименте на мышах показано, что опухолевые клетки попадают в кровоток через кровеносные сосуды метастатически пораженных лимфатических узлов, которые служат выходным путем для системного распространения опухолевых клеток [20]. Гематогенное и лимфогенное метастазирование имеют некоторые общие характеристики. Метастатический каскад состоит из нескольких последовательных этапов, направленных на колонизацию либо лимфатических узлов, либо отдаленных органов. Опухолевые и стромальные клетки первичной опухоли секретируют проангио-генные факторы, такие как VEGF, для стимулирования сети микроциркуляторного русла опухоли как в кровеносных, так и в лимфатических сосудах. Показано в эксперименте, что для карциномы легких Льюиса семейство VEGF играет ключевую роль в формировании лимфатических сосудов. Среди членов этого семейства VEGF-C и VEGF-D являются одними из наиболее важных факторов, участвующих в лимфангиогенезе посредством связывания с рецепторами фактора роста эндотелия сосудов-2 и -3 (VEGFR-2 и VEGFR-3) [21, 22]. Молекулярным регулятором активации VEGFR-3 является мембранный корецептор NRP-2 [23].

В процессе опухолевого прогрессирования опухолевые клетки подвергаются эпителиальномезенхимальному переходу (ЭМП), который способствует развитию подвижности клеток за счет потери белков межклеточной адгезии, таких как Е-кадгерин и β-катенин [24]. Подвижные клетки мигрируют и вторгаются в базальную мембрану близлежащей сосудистой сети. Лимфатическая система может активно способствовать миграции опухолевых клеток в лимфатические сосуды, в то время как опухолевые факторы роста стимулируют внутриопухолевый и перитуморальный лимфан-гиогенез, способствуя лимфоваскулярной инвазии [25]. Центральным моментом лимфангиогенеза яв- ляются пролиферация и миграция лимфатических эндотелиальных клеток (LEC). При НМРЛ лимфатические эндотелиальные клетки опосредуют образование лимфатических сосудов и одновременно способствуют приобретению метастатического фенотипа опухолевыми клетками. Показано, что активация транскрипционного фактора PROX1 в LEC приводила к лимфангиогенезу и метастазам НМРЛ в лимфатические узлы [26]. Различные секреторные факторы индуцируются для экспрессии и стимулирования LEC-опосредованного лимфан-гиогенеза и лимфогенного метастазирования. В этом процессе, кроме VEGFR-2 и VEGFR-3, важную роль играют с-MET тирозинкиназа, NRP-2 и рецептор эритропоэтин-продуцирующей гепатомы A (EphA) [12]. Лимфатические сосуды важны для связи опухоли с организмом хозяина, передавая молекулярную информацию от первичной или метастатической опухоли к регионарным лимфатическим узлам и системе кровообращения. Помимо транспорта антигенов, LEC, особенно те, которые расположены в синусах лимфатических узлов, признаны прямыми регуляторами опухолевого иммунитета и реакции на иммунотерапию, представляя опухолевые антигены и экспрессируя несколько иммуномодулирующих сигналов, включая PD-L1 [27]. Факторы роста тромбоцитов (PDGF) и их рецепторы (PDGFR) являются важными факторами, влияющими на лимфогенное метастазирование при раке легкого, PDGF-В является паракринным регулятором, который стимулирует LEC, экспрессирующие PDGFR [28]. Совместная экспрессия PDGF-B и VEGFR-3 в клетках рака легкого связана с лимфогенным метастазированием и плохим прогнозом [29]. Первичный опухолевый ангиопоэтин-2 (Ang2) является мощной терапевтической мишенью для ограничения лимфогенной диссемина-ции. Опухолеассоциированные LEC, в отличие от эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, критически зависимы от пути ангиопоэтина-Tie. Эксперименты по генетическим манипуляциям в сочетании с картированием одиночных клеток выявили агонистически действующую передачу сигналов Ang2-Tie2 как ключевой регулятор поддержания лимфатической системы [30].

В случае лимфогенного метастазирования при интравазации опухолевые клетки будут дренироваться в собирательные лимфатические сосуды, в конечном итоге попадать в сторожевые или «дренирующие опухоль лимфатические узлы» [31]. Успешная миграция в сторожевые лимфатические узлы обеспечивает клеткам прямой путь к системным лимфатическим узлам через грудной проток и подключичную вену [32, 33]. В лимфатических капиллярах отсутствуют перициты и плотные межэндотелиальные соединения, которые обычно наблюдаются в кровеносных сосудах [32]. Неплотная природа лимфатических сосудов облегчает интравазацию опухолевых клеток посредством трансэндотелиальной миграции, спо- собствуя начальному метастазированию. Получено много данных, свидетельствующих о том, что лимфатические сосуды также могут играть роль в сдерживании противоопухолевых иммунных ответов [34]. Например, лимфатические сосуды, образующиеся в результате опухолеиндуцированного лимфангиогенеза, демонстрируют повышенную экспрессию лиганда иммунного контроля программированной гибели клеток (PD-L1) [35]. Высокая мутационная нагрузка опухоли и экспрессия PD-L1 при НМРЛ связаны с усиленной внутриопухолевой инфильтрацией иммунных клеток [36]. PD-L1+ опухолевые стволовые клетки обладали иммуносупрессивным потенциалом, который коррелировал с прогрессированием рака легких и плохим прогнозом [37].

Регуляция молекул, вовлеченных в лимфогенное метастазирование, может осуществляться на нескольких уровнях – транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном. Важную роль в посттрансляционной регуляции биологических молекул принадлежит УПС, как наиболее значимой системе специфического внутриклеточного протеолиза [38]. Однако в настоящее время нет достаточно данных для однозначного ответа на вопрос о влиянии протеасом на процессы лимфогенного метастазирования злокачественных опухолей.

Убиквитин-протеасомная система при НМРЛ

Убиквитин-протеасомная система включает в себя компоненты, ответственные за узнавание белков-мишеней, подлежащих разрушению, и последующую их деградацию. Протеасомы представлены двумя типами: 20S-протеасомой, так называемой коровой (core) частицей, и 26S-протеасомой, содержащей в своем составе две регуляторные частицы 19S [39]. Протеолиз происходит в каталитическом ядре (20S протеасоме), состоящем из четырех колец, расположенных друг над другом. Каждое из двух внутренних β-колец образовано семью различными β-субъединицами и отвечает за протеолиз. Три из этих β-субъединиц (β1, β2 и β5, кодируемые генами PSMB6, PSMB7 и PSMB5 соответственно) проявляют специфические субстратные каталитические активности: каспазаподобную, трипсинподобную и химо-трипсинподобную [40]. Несмотря на возможность расщепления белков 20S-протеасомой, именно 26S протеасома быстро разрушает белки, которые помечены для деградации убиквитином, т. к. 19S частицы способны распознавать убиквитинирован-ные белки, а также расплетать их и проталкивать в протеолитическую камеру (20S), где в дальнейшем и происходит их разрушение [41]. Если в роли регуляторной частицы выступает белковый комплекс РА28, то такая ассоциация представляет собой активированную 20S-протеасому, которая расщепляет до 20 % внутриклеточных белков и пептидов. Комплекс PA28αβ демонстрирует спо- собность ускорять вход развернутого субстрата или ускоренный выход пептидов из 20S-протеасомы, влияя на их размер. Предполагается, что это стимулирует выработку широкого спектра пептидов, подходящих для презентации антигена [42].

Под действием цитокинов, таких как, например, гамма-интерферон, протеолитические субъединицы β1, β2 и β5 конститутивных 20S протеасом могут быть заменены на иммунные (индуцибельные) β1i, β2i и β5i (LMP2, MECL-1 и LMP7). Протеасомы, содержащие эти субъединицы, называются иммунопротеасомами [14]. Замена конститутивных субъединиц на иммунные сопровождается изменением их специфичности, вследствие чего они продуцируют иммуногенные пептиды, презентируемые главным комплексом гистосовместимости класса I [40, 43]. Показано увеличение активности протеасом в злокачественных новообразованиях различных локализаций [44]. Выявлены изменения химотрипсинподобной и каспазаподобной активностей протеасом при раке легкого в ряду: неизмененная ткань, первичная опухоль, метастазы. Они заключаются в повышении исследуемых протеолитических активностей в ткани первичных опухолей и метастазов по сравнению с неизмененной тканью. Кроме того, в тканях первичного рака легкого наблюдается возрастание каспазаподобной активности протеасом в опухолях стадии Т1–3N1–2M0 по сравнению со стадией Т1–3N0M0 [45]. Таким образом, протеасо-мы могут быть вовлечены в процесс лимфогенного метастазирования при НМРЛ. Вероятно, участие протеасом в лимфогенном метастазировании обусловлено работой иммунопротеасом, т. к. они играют важную роль в функционировании лимфатической системы. Показано, что лимфатические эндотелиальные клетки экспрессировали сопоставимые уровни транскриптов конститутивных субъединиц протеасом и регуляторных субъединиц 19S. Однако LEC из лимфоузлов экспрессировали в 5–8 раз более высокие уровни транскриптов генов, кодирующих иммунопротеасомы: PSMB8 , PSMB9 и PSMB10 и в два раза больше PA28α и β . Это указывает на то, что LEC, локализованные в лимфоузлах, преимущественно экспрессируют иммунопротеасомы [46].

Существуют исследования, указывающие на участие протеасом в регуляции ангиогенеза и процессах клеточной локомоции, которые обусловливают высокую метастатическую активность опухолевых клеток. УПС играет центральную роль в функционировании основных проангиогенных белков, включая VEGF, VEGFR-2, и ангиогенных сигнальных белков, например киназы PLCγ1 и PI3/AKT [47]. Выявлено, что при раке легкого механизмы клеточной подвижности, которые важны для метастазирования, регулируются внутриклеточными протеасомами. Так, показано возможное регуляторное влияние каспазаподобной активности протеасом на содержание β-катенина, а также актин- связывающих белков CAP1 и кофилина, принимающих участие в миграции опухолевых клеток в тканях НМРЛ [48, 49]. Интегративный геномный и протеомный анализ клеточных линий НМРЛ выявил значительное снижение экспрессии компонентов иммунопротеасом и их регуляторов, связанных с ЭМП. Низкая экспрессия субъединиц иммунопро-теасом у пациентов с НМРЛ на ранней стадии была связана с рецидивами и метастазами [50].

Иммунопротеасомы рассматриваются как мишень для терапии НМРЛ. Обнаружено повышение экспрессии генов PSMB8 и PSMB9 , кодирующих субъединицы иммунопротеасом в культурах клеток НМРЛ. Показано, что иммунопротеасомы могут быть эффективной терапевтической мишенью при цисплатин-резистентном раке легкого. Про-теасомная протеолитическая активность может быть прогностическим маркером эффективности ингибиторов иммунопротеасом при НМРЛ [51]. Ингибитор протеасом карфилзомиб ингибировал активность как конститутивных, так и иммунопро-теасом в клеточных линиях рака легких, оказывая антипролиферативный эффект [52]. На клеточных линиях рака легкого было показано, что субъединица протеасом PSMA6 может служить терапевтической мишенью. В настоящее время проводится поиск новых ингибиторов протеасом для лечения различных молекулярных типов рака легкого. Найден химический ингибитор активности 20S-протеасомы, который тормозил рост органоидов