Роль эритропоэтина в реализации межклеточных взаимодействий в крови у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности

Клеточные взаимосвязи в крови представлены при многих патологических ситуациях: воспалении, опухолевом росте, тромботических состояниях, атеросклерозе, аутоиммунных поражениях, сепсисе и его осложнениях и других, они определяют как типовые, так и специфические проявления болезни, в одних случаях могут иметь положительное значение, в других - инициировать или развивать патологический процесс. Межклеточные взаимодействия в крови оказывают влияние на проявления функциональной активности клеток и имеют значение в осуществлении защитных и восстановительных реакций. Реализация клеточных регуляторных влияний в одних случаях может быть обеспечена соединениями, высвобождаемыми клетками в окружающую среду, в других - требуется непосредственный контакт между клетками. Факторами, обеспечивающими межклеточные контакты, являются адгезивные молекулы, компоненты внеклеточного матрикса, растворимые медиаторы и онкогены.

У больных хронической почечной недостаточностью (ХПН) на феноменологическом уровне накоплено значительное количество данных об изменении рецепторного аппарата клеток крови. У пациентов с уремией отмечаются нарушения рецепторной функции комплекса гликопротеиновых рецепторов lb, IIb-Ша, Р-селектина, что проявляется дефектом связывания фибриногена и фактора фон Виллебранда с тромбоцитами, тромбоцитов с лейкоцитами и эндотелиоцитами [10,14, 19, 23,26, 28]. Этот дефект частично обратим при лечении гемодиализом. Доказано, что у больных ХПН имеются изменения фосфолипидного состава мембран клеток крови, зависящие от степени уремической интоксикации и приводящие к экстернализации фосфатидилсерина, это, в частности, изменяет кооперацию эритроцитов с другими клетками [1]. Расшифровка механизмов межклеточных взаимодействий в крови может прояснить развитие многих осложнений при ХПН, в том числе, тромбогеморрагических, инфекционных, анемии и др. [6,20,29].

Эритропоэтин (ЭПО), являющийся средством заместительной терапии у больных с терминальной стадией ХПН, в настоящее время рассматривается не только как регулятор активности гемопоэтической ткани, ответственный за пролиферацию, дифференцировку, угнетение апоптоза в чувствительных к нему гранулоцитарно-моноцитарно-мегакариоцитарно-эритроцитарных колониеобразующих единицах и эритробластах, что приводит к увеличению количества эритроцитов в периферической крови [5]. Все большее внимание научной медицинской общественности привлекают плейо-тропные эффекты ЭПО. Показана способность ЭПО оказывать влияние на аффективный статус, функциональное состояние нервной системы при различной патологии человека в клинических и экспериментальных условиях [9, 15, 18, 26]. Эритропоэтин изменяет численный состав и функциональную активность лейкоцитов, оказывает влияние на гемореологию [2, 17, 21].

Представленные факты явились предпосылкой для проведения настоящего исследования, цель которого - исследовать факт и установить некоторые механизмы влияния эритропоэтина на межклеточные взаимодействия в крови у больных хронической почечной недостаточностью.

Материалы и методы исследования. Первоначально обследовано 160 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 22 до 72 лет (средний возраст 45,5 лет), находящихся на постоянном лечении в отделении диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница». После рандомизации в исследование включено 50 больных, из них 24 женщины и 26 мужчин. Критерии исключения: декомпенсация со стороны сердечнососудистой, дыхательной, пищеварительной систем; наличие в анамнезе туберкулеза, венерических заболеваний, гепатита, ВИЧ-инфекции, онкологической патологии; острые нарушения церебрального кровообращения; наличие острого воспалительного процесса; беременность; гемоглобин ниже 80 г/л; тромбоцитов менее 150-109/л. Все больные получали гемодиализную терапию на аппаратах «искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» 2 раза в неделю сеансами по 5 часов, Kt/v 1,37 ± 0,06. Группа I - контроль (п = 10), здоровые люди - доноры областной станции переливания крови. Группа II - больные ХПН (п = 20). Группа III - больные ХПН (п = 30), получающие рекомбинантный человеческий эритропоэтин в составе препарата «Эпокрин» (ФГУП «НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА», Россия) 2 раза в неделю внутривенно в дозе 2000 ME в течение 2 месяцев. Суммарная доза введенного эритропоэтина составила около 40 000 ME. Кровь для исследований у больных ХПН забирали из артериального колена артерио-венозной фистулы до сеанса гемодиализа.

Обогащенную тромбоцитами плазму получали центрифугированием цельной крови и стандартизировали количество тромбоцитов в полученной плазме на гематологическом анализаторе «AST-diff» (Beckman Coulter, США). Тромбоцитарно-лейкоцитарную кооперацию исследовали на проточном цитофлюориметре «FACS Canto-П» (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител, меченных CD61+-FITC (флюоресцеинизо-тиоцианат) (Beckman Coulte, США); CD41+-FITC (Beckman Coulter, США); CD42b+-PE (фикоэритрин) (Becton Dickinson Pharmingen, США). Популяции лейкоцитов (лимфоциты, моноциты и гранулоциты) выделяли на основании определения в гейте СО45-позитивных событий с использованием моноклональных антител к CD42b+-PE (Becton Dickinson Pharmingen США), а также по показателям светорассеивания. Оценка осуществлялась по относительному количеству (%) лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, взаимодействующих с тромбоцитами. Эритроцитарно-тромбоцитарные взаимодействия исследовали после перемешивания и инкубации суспензии эритроцитов и тромбоцитов с концентрацией 300 109/л и Ю1010/л соответственно, в камере Горяева подсчитывали количество эритроцитарно-тромбоцитарных коагрега-тов (ЭТК) в единице объема (8). Агрегацию тромбоцитов исследовали на лазерном агрегометре АЛАТ2-«Биола» (Россия). На поверхности тромбоцитов определяли экспрессию гликопротеидов тромбоцитов CD61+ (Gp Ilb/IIIa); CD41+; CD42b+

(Gp Ib/Ix). Кроме того, оценивали % тромбоцитов, экспрессирующих CD42b+. Оценивали среднепиковое значение в условных единицах (у.е.) флюоресценции.

Количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе фирмы «Orphee» (Япония) волюмометрическим методом. Уровень продукции эндогенного оксида азота (II) оценивали по концентрации конечных стабильных метаболитов NO с помощью реакции Griess в модификации Коробейниковой Э.Н. [4]. Результат выражали в мкмоль/л. Выраженность эндогенной интоксикации оценивали по содержанию веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ) в плазме [8]. Концентрацию мочевины и креатинина в сыворотке определяли соответственно энзиматическим колориметрическим методом и кинетическим методом без депротеинизации на аппарате «Roki-бТ» (СПб., Россия) с использованием реактивов фирмы «Human» (Германия).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 6.0 for Windows» [3, 11]. Для анализа вида распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка, для проверки равенства дисперсий в группах - критерий Левена. Учитывая, что большинство исследуемых показателей имели распределение признака в выборках, отличающееся от нормального, данные представляли в виде медианы (Me) и размаха квартилей (Q25 - Qis)- Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна-Уитни (U), Вальда-Вольфовитца (WW). Для оценки связи между показателями использовали методы корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Спирмена (R). Отличия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что у больных ХПН снижается количество тромбоцитов в периферической крови (табл. 1). Полагают, что развитие тромбоцитопении связано с угнетением тромбоцитопоэза и усилением тромбоцитодиэреза в условиях уремической интоксикации, дефицита эритропоэтина и тромбопоэтина при ХПН [22]. Содержание в плазме ВНиСММ, креатинина и мочевины у больных ХПН многократно возрастают (табл. 2). Межклеточные взаимодействия в крови у больных ХПН изменяются неоднозначно. Взаимодействие тромбоцитов друг с другом в ходе агрегации уменьшается, так как снижается скорость агрегации преимущественно за счет удлинения этого процесса. На этом фоне также угнетаются процессы взаимодействия тромбоцитов с эритроцитами, тромбоцитов с лимфоцитами. При этом отмечен рост тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов в периферической крови.

До настоящего момента общепризнанной остается концепция о том, что нарушения функции тромбоцитов являются следствием их контакта с

Таблица 1

Влияние эритропоэтина на показатели межклеточной кооперации в крови и экспрессию тромбоцитарных рецепторов у больных хронической почечной недостаточностью

Показатели	Группа 1 (контроль) п = 10		Группа 2 (больные ХПН) п = 20		Группа 3 (больные ХПН+ЭПО) п = 30
	Me	Q25-Q75	Me	Q25 ~ Q75	Me	Q25“Q?5
Тромбоциты, -109/л	230	229-252	167*	152-213	216* **	189-243
ТЦ-НФ кооперация, % клеток	22,8	22,3-24,4	23,0*	19,1-37,6	26,9**	22,6-30,0
ТЦ-МЦ кооперация, % клеток	24,7	21,7-24,9	26,0*	20,7-58,4	26,8**	21,2-32,6
ТЦ-ЛЦ кооперация, % клеток	21,5	19,9-22,9	16,0*	13,7-17,6	20,95**	18,5-22,8
ТЭК, 1010/л	101,4	91,9-142,8	62,6*	49,8-82,5	87,6* **	71,2-112,3
Амплитуда агрегации, %	75,4	44,7-160,9	129,3	65,6-127,4	111,1	86,5-136,9
Время агрегации, мин	1,48	0,88-1,55	4,23*	1,55-6,9	1,5** .	1,35-1,65
Скорость агрегации, %/мин	66,8	50,9-84,2	35,2*	27,9-42,3	70,2**	64,5-84,0
CD61+, у. е.	1,59	1,56-1,66	1,34*	0,87-1,46	1,66**	1,40-1,81
CD41+, у. е.	1,96	1,87-2,04	2,62*	2,39-3,10	2,46* **	2,29-2,90
CD42b+, у. е.	537	461-673	614*	566-969	644**	549-842
Тромбоциты CD42b+, %	78,0	72,1-94,6	74,9*	49,9-81,5	87,6**	78,1-94,1

Примечание. Здесь и в табл. 2 * - статистически значимые (р < 0,05) отличия с группой 1;

** - с группой 2.

Таблица 2

Влияние эритропоэтина на показатели эндогенной интоксикации и содержание стабильных метаболитов оксида азота (II) в плазме у больных хронической почечной недостаточностью

Показатели	Группа 1 (контроль) п= 10		Группа 2 (больные ХПН) п = 20		Группа 3 (больные ХПН+ЭПО) п = 30
	Me	Q25 - Q75	Me	Q25 ~ Q75	Me	Q25 - Q75
NOX, мкмоль/л	9,4	9,1-10,4	21,6*	14,5-26,8	12 9* **	12,0-18,0
NO2, мкмоль/л	2,5	2,2-2,9	5,6*	3,2-6,3	3 2*	2,8-4,2
NO3, мкмоль/л	6,9	6,3-7,9	14,8*	8,2-22,8		8,6-14,2
ВНиСММ, у. е.	0,6	0,57-0,69	1,63*	1,38-1,71	1 45* **	0,84-1,55
Креатинин, мкмоль/л	73	67-82	947*	855-1256	**	841-917
Мочевина, ммоль/л	5,6	4,7-5,8	31,3*	28,2-38,3	2§ 9* **	24,3-34,6

«уремическими токсинами», что приводит к структурным дефектам рецепторного аппарата [13].

Нами установлено, что у больных ХПН уменьшается экспрессия CD61+ (Gp Ilb/IIIa) на поверхности тромбоцитов. Это приводит к нарушению связывания тромбоцитами фибриногена и фактора Виллебранда, опосредующих феномен тромбоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия. Заслуживает внимания факт повышения экспрессии на поверхности тромбоцитов CD41+; CD42b+ (Gp Ib/Ix), однако, % тромбоцитов, экспрессирующих CD42b+, статистически значимо снижался, что позволяет предположить компенсаторный характер гиперэкспрессии CD42b+. Исследования дисфункции тромбоцитов при уремии группой итальянских ученых в течение 30 лет позволили установить, что механизм нарушения агрегации тромбоцитов связан с эффектами гуанидинянтарной кислоты, накапливающейся в крови у больных с ХПН вследствие усиления метаболизма L-аргинина по альтернативному пути [24]. Механизм опосредован активацией NO-синтазы в тромбоцитах и повышением уровня внутриклеточного NO. Нами установлено, что в сыворотке у больных ХПН повышено общее содержание конечных метаболитов NO за счет нитритов и нитратов (см. табл. 2).

Полагают, что изменение эритроцитарно-тромбоцитарной коагрегации при ХПН обусловлено подавлением активности тромбоцитов, однако точный механизм этого феномена, как и обеспечивающие его структурные элементы не установлены [25].

Отдельного обсуждения заслуживают разнонаправленные изменения тромбоцитарно-лейкоцитарной кооперации в крови у больных ХПН.

Тромбоцитарно-нейтрофильные взаимодействия первоначально обеспечивается на тромбоцитах Р-селектином (CD 62), на лейкоцитах - PSGL-1 (P-selectin glycoprotein Ligand) и L-селектином (18). Более прочная связь клеток осуществляется 02-интегрином (CDllb/CD18, МАС-1) нейтрофилов и ICAM-2 тромбоцитов [16]. Кроме этого, имеет значение фибриногеновый «мост» между р2-интег-рином на нейтрофилах и GPIIb/IIIa на тромбоцитах [29]. Ряд авторов также отмечают рост тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных, но не тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов у больных ХПН [12, 26, 27, 30]. Полагают, что такой дуализм может быть обусловлен специфическими лиганд-рецепторными взаимодействиями тромбоцитов с нейтрофилами и моноцитами, но не лимфоцитами.

В то же время, количество тромбоцитарнолимфоцитарных коагрегатов является чувствительным тестом, отражающим состояние гомеостаза при инфекционных и воспалительных заболеваниях, особенно сопровождающихся вторичными иммунодефицитами и ДВС-синдромом [7]. Снижение количества тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов может быть связано с динамическим изменением их содержания в крови: первоначальное увеличение в 2-3 раза сменяется резким снижением, возможно, в связи с уходом в ткани, так как в лимфе при этом обнаруживается большое число лимфоцитов, образующих розетки с тромбоцитами.

Применение ЭПО у больных ХПН приводит к частичному восстановлению количества тромбоцитов, показателей межклеточных взаимодействий в крови и экспрессии тромбоцитарных гликопро теинов у больных ХПН (см. табл. 1). Скорость агрегации тромбоцитов увеличивается за счет укорочения процесса, восстанавливая, таким образом, тромбоцитарно-тромбоцитарные взаимодействия до уровня контрольной группы. Количество нейтрофилов и моноцитов, взаимодействующих с тромбоцитами, уменьшается, а количество лимфоцитов - увеличивается, кроме того, возрастает представительство тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов. На фоне применения эритропоэтина экспрессия тромбоцитарных гликопротеинов CD61+ (Gp ПЫШа) увеличивается, CD41+; CD42b+ (Gp Ib/Ix) - уменьшается, а количество тромбоцитов, имеющих на поверхности CD42b+ - увеличивается.

Изменение под влиянием эритропоэтина рецепторного состава тромбоцитов оказало влияние на тромбоцитарно-клеточные взаимодействия в крови у больных ХПН, так, уменьшение количества нейтрофилов и моноцитов, взаимодействующих с тромбоцитами, опосредовано уменьшением экспрессии CD41* и CD42b+; активация тромбоцитарно-лимфоцитарных взаимодействий зависит от экспрессии CD61+.

Изменение межклеточной кооперации в крови опосредовано угнетением нитроксидергических процессов у больных ХПН, находящихся на заместительной терапии эритропоэтином. Обнаружена статистически значимая отрицательная связь между скоростью агрегации тромбоцитов, количеством тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов, а также количеством лимфоцитов, взаимодействующих с тромбоцитами и содержанием продуктов NO в сыворотке (табл. 3). Выявлено, что

Таблица 3 Корреляция между показателями межклеточной кооперации и показателями интоксикации, содержания метаболитов оксида азота (II), экспрессии тромбоцитарных рецепторов у больных ХПН в условиях применения эритропоэтина

Показатели	СПбГ	CD41+	CD42b+	CD42b+, %	NOx	no2	NO3	ВНиСММ	Креатинин	Мочевина
ТЦ-НФ кооперация, % клеток	0,16	0,49	0,69	-0,97	0,64	0,39	0,53	0,67	0,55	0,60
тц-мц кооперация, % клеток	0,89	0,70	0,11	-0,60	0,86	0,36	0,95	-0,01	-0,06	-0,24
ТЦ-ЛЦ кооперация, % клеток	0,93	-0,32	0,53	0,12	-0,43	-0,84	-0,64	0,48	-0,42	-0,73
ТЭК, 1010/л	0,81	0,23	0,17	0,31	-0,74	-0,69	-0,54	-0,78	-0,52	-0,68
Амплитуда агрегации, %	0,16	-0,65	-0,99	-0,77	-0,56	-0,88	-0,33	-0,19	-0,01	-0,37
Время агрегации, мин	0,73	-0,03	-0,66	-0,09	0,18	0,92	0,42	-0,02	0,08	-0,33
Скорость агрегации, %/мин	-0,34	-0,83	-0,82	-0,97	-0,88	-0,47	-0,75	-0,26	-0,09	-0,25

Примечание. В таблице представлены значения коэффициента корреляции Спирмена, жирным шрифтом отмечены статистически значимые (р < 0,05) связи.

активность тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных взаимодействий падает по мере снижения содержания конечных стабильных метаболитов оксида азота (II).

Обнаружено, что эритропоэтин обладает выраженным дезинтоксикационным действием, снижает концентрацию ВНиСММ, креатинина и мочевины в плазме (см. табл. 2). Результаты корреляционного анализа у больных ХПН, продемонстрировали благоприятное влияние дезинтоксикаци-онного эффекта эритропоэтина на межклеточные кооперации в крови (см. табл. 3). Прежде всего, это проявилось положительными средней силы корреляциями уровня ВНиСММ, креатинина и мочевины с количеством нейтрофилов, активно взаимодействующих с тромбоцитами, а также отрицательными корреляциями данных показателей с количеством тромбоцитарно-лимфоцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов.

Таким образом, у больных с терминальной стадией ХПН наблюдаются изменения межклеточных взаимодействий в крови: активируются взаимодействия тромбоцитов с клетками фагоцитарного ряда (нейтрофилами и моноцитами) и угнетаются - с лимфоцитами, эритроцитами, а также тромбоцитарно-тромбоцитарные контакты. Применение эритропоэтина в течение двух месяцев в суммарной дозе около 40 000 ME приводит к частичному восстановлению межклеточной кооперации в крови. Установлено, что механизмами цито-протекторного действия эритропоэтина выступают нормализация рецепторного состава мембраны тромбоцитов, включая CD61+ (Gp Ilb/IIIa); CD41+; CD42b+ (Gp Ib/Ix), дезинтоксикационный эффект и восстановление нитроксидергических процессов.