Роль макрофагов в регуляции биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха

Известно, что макрофаги играют важную роль в формировании противоопухолевой защиты, а их цитотоксическая активность связана с секрецией ряда цитокинов и активированных кислородных метаболитов. Одним из факторов, участвующих в реализации противоопухолевого эффекта макрофагов, может быть аполипопротеин Е, содержание которого составляет 10–25 % от общего секретируемого этими клетками белка [17]. В литературе аполипопротеин Е известен как ингибитор пролиферации клеток различных тканей, включая опухолевые [9, 11, 12, 13, 16]. Вместе с тем в последние годы получены данные об участии макрофагов в прогрессии опухоли. В ряде работ показано, что с ростом опухоли количество макрофагов, их противоопухолевая и антигенпрезентирующая активность снижаются [7, 10, 15]. Функциональные характеристики макрофагов модулируются опухолевым микроокружением, при этом клетки приобрета- ют способность поддерживать опухолевый рост, стимулируя ангиогенную активность опухоли, усиливая ее инвазивный и метастатический потенциал [8, 10, 14]. Таким образом, судьба опухоли во многом определяется функциональной активностью инфильтрующих ее макрофагов.

Ранее в Институте биохимии СО РАМН было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации [2]. В основе механизма этого явления лежит образование биологически активного комплекса «аполипопротеин А-I-тетрагидрокортизол». Показано, что макрофаги кооперативно захватывают липопротеины высокой плотности (ЛПВП) и кортизол. ЛПВП при участии лизосомальных гидролаз подвергаются дезинтеграции с освобождением аполипопротеина А-I, а кортизол подвергается действию внутриклеточных редуктаз с образованием тетрагидрокортизола. Полученные продукты формируют биологически активный комплекс, который, попадая в соматические клетки, взаимодействует с ДНК и усиливает экспрессию генов [4]. Мы полагаем, что этот механизм реализуется и в системе «макрофаг – опухолевая клетка» и может лежать в основе опухолевого роста. Изучению данного вопроса и посвящено настоящее исследование.

Материал и методы

В качестве экспериментальной модели использовали культуру клеток асцитной карциномы Эрлиха, выделенную из мышей линии CBA массой 15–20 г в лог-фазе опухолевого роста (Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск), в качестве контроля – макрофаги здоровых мышей, выделенные из перитонеального «лаважа». Мышей забивали под легким эфирным наркозом с помощью цервикальной дислокации. Свежевыделенные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 («Биолот», Россия), рН 7,4, содержащей 20 мM HEPES («ICN Biomedicals, Inc», США), 2 мM L-глутамина («Вектор», Россия), 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл гентамицина, 5,6 мM глюкозы. Жизнеспособность клеток, оцениваемая методом исключения трипанового синего («Serva», Германия), составляла не менее 95 %. Инкубацию проводили в СО2-инкубаторе («Cole-Parmer», США) в атмосфере, содержащей 5 % СО2 и 95 % воздуха, при температуре 37ºС, используя 6-луночные планшеты («Orange Scientific», США). Плотность клеток составляла 1,5 тыс/мм2. Для получения культуры клеток асцитной карциномы, свободной от макрофагов, исходную суспензию клеток инкубировали 30 мин, а после адгезии макрофагов содержимое лунки переносили в другой планшет.

Скорость биосинтеза белка в культуре клеток асцитной карциномы определяли по включению 14С-лейцина («Amersham», Англия). Метку добавляли в количестве 2 мкКи/мл среды за 3 ч до окончания инкубации. Реакцию останавливали добавлением 0,2н раствора NaOH. Для измерения радиоактивности содержимое лунки переносили на целлюлозные фильтры («Whatman 3 MM», Англия), которые последовательно промывали от несвязавшейся метки раствором 10 % трихлоруксусной кислоты и смесью этанол-эфир (1:1).

Фильтры для измерения радиоактивности белка предварительно обрабатывали 0,1 М раствором лейцина в 10 % трихлоруксусной кислоте. Радиоактивность образцов измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике («Mark-III», США) и выражали в имп/мин на 1 мг белка. Количественное определение белка проводили по методике Варбурга и Кристиана [1].

Для анализа спектра внутриклеточных белков макрофагов клетки лизировали раствором, содержащим 10 мМ фосфорнокислого натрия, рН 7,2, 85 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,5 % дезоксихолат натрия и 1 % Тритон X-100. Выделение липопротеинов плазмы крови проводили методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na₂ на центрифуге «Optima L-90K, Beckman-Coulter» (Австрия). Полученные липопротеины диализовали 24 ч против 0,05 М калий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl и 0,3 мМ ЭДТА-Na₂ при 4 ° С. Аполипопротеины А-I (апоА-I) и Е (апоЕ) получали путем делипиди-рования липопротеиновых фракций высокой (ЛПВП) и очень низкой плотности (ЛПОНП), соответственно, охлажденной смесью этанол-ацетон (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром и гель-фильтрации (колонка: 1,6 х 100 см, Сефароза CL-6B («Amersham Biosciences», Швеция), элюент: 0,01 М трис-HCl буфер, pH 8.6, содержащий 6 М мочевину, 0,01 % азид натрия, 1мМ фенилметансульфонил фторид). Анализ чистоты аполипопротеинов проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия («Serva», Германия). В качестве маркеров использовали набор низкомолекулярных белков-стандартов («Pharmacia», Швеция), включающий фосфорилазу – 94 кДа, альбумин – 67 кДа, овальбумин – 43 кДа, карбоангидразу – 30 кДа и лактальбумин – 14,4 кДа. Белковые полосы визуализировали 0,1 % Кумасси G-250 в смеси метанола и 10 % уксусной кислоты (1:1).

Обессоливание аполипопротеинов проводили с помощью гель-фильтрации (колонка: 20 х 0,8 см, Сефадекс G-25 («Pharmacia», Швеция), элюент: 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl). Иммуноэлектроблоттинг проводили «полусухим» методом с использованием нитроцеллюлозных мембран

(«Schleicher & Schuell», ФРГ) c диаметром пор 0,45 мкм. Специфические антитела против апоА-I и апоЕ, выделенных из плазмы крови человека, получали описанным нами ранее методом [3]. Электрофореграммы и данные иммуноэлектроблоттинга обрабатывали с помощью компьютерной программы TotalLab (Biosystematics, New Horizons in gel imaging and analysis). Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При изучении роли макрофагов в регуляции биосинтеза белка в опухолевых клетках представлялось интересным сравнить спектры внутриклеточных белков перитонеальных макрофагов здоровых мышей и мышей с асцитной карциномой Эрлиха. Электрофоретический анализ внутриклеточных белков показал, что их спектры отличаются между собой (рис. 1). В белковом спектре опухоль-ассоциированных макрофагов было обнаружено меньшее количество низкомолекулярных и повышенное содержание средне- и высокомолекулярных фракций. Среди внутриклеточных белков следует отметить банд, соответствующий по молекулярной массе

Рис. 1. Электрофореграмма внутриклеточных белков перитонеальных макрофагов мышей:

1 – опухоль-ассоциированные макрофаги; 2 – макрофаги здоровых мышей; 3 – белки ЛПОНП апоЕ (34 кДа). Этот банд был более выражен в лизате макрофагов здоровых мышей, что было подтверждено и методом иммунофер-ментного анализа. Иммуноэлектроблоттинг и денситометрический анализ показали, что в опухоль-ассоциированных макрофагах снижено содержание апоЕ в дегликозилированной проформе почти в 2 раза по сравнению с контролем, что может свидетельствовать о нарушении посттрансляционной модификации данного белка.

Для доказательства роли макрофагов в опухолевом росте и участия липопротеинов в этом процессе мы инкубировали клетки с ЛПВП (1 мг белка на 1 мл среды), выделенных из плазмы крови человека. Присутствие в инкубационной среде ЛПВП приводило к поглощению их макрофагами (рис. 2А). Среди множества внутриклеточных белков макрофагов в клеточном лизате появился белковый банд, соответствующий по молекулярной массе апоА-I (28,3 кДа). Этот банд по иммунохимической характеристике действительно соответствовал апоА-I человека, что было доказано методом иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических антител (рис. 2Б, дорожки 2, 4). Кроме основной формы апоА-I, идентифицированы продукты метаболической деградации этого белка с молекулярными массами от 26 до 6 кДа. Количественный анализ поглощенного макрофагами белкового компонента ЛПВП показал, что опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются значительно меньшей способностью к поглощению и метаболической деградации апоА-I.

Известно, что макрофаги обладают высокой активностью 5 α - и 5 β -редуктаз, восстанавливающих ∆-4,3-кетогруппу в кольце А стероидных гормонов с образованием тетрагидросоединений [6]. Продуктом метаболизма ЛПВП и кортизола в макрофагах является комплекс апоА-I с тетрагидрокортизолом. В связи с этим мы провели исследования по влиянию кортизола на поглощение и метаболическую деградацию белкового компонента ЛПВП. Оказалось, что кортизол в концентрации 1 × 10^-6 М оказывает стимулирующее влияние на поглощение ЛПВП и метаболическую деградацию апоА-I как макрофагами здоровых мышей, так и макрофагами мышей с карциномой (рис. 2Б, дорожки 3, 5). Но

Рис. 2. Оценка поглощения и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП перитонеальными макрофагами мышей: А – результаты электрофореза в 12,5 % ПААГ: 1 – опухоль-ассоциированные макрофаги; 2 – опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП; 3 – апоА-1 (стандарт); 4 – макрофаги здоровых мышей + ЛПВП; 5 – макрофаги здоровых мышей;

Б – результаты иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических апоА-1-антител: 1 – апоА-1 (стандарт); 2 – макрофаги здоровых мышей + ЛПВП; 3 – макрофаги здоровых мышей + ЛПВП + кортизол; 4 – опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП; 5 – опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП + кортизол

при этом более выраженный эффект кортизола был отмечен для опухоль-ассоциированных макрофагов. Количественный анализ показал, что добавление гормона увеличивало поглощение ЛПВП макрофагами здоровых мышей в 1,6 раза, а опухоль-ассоциированными – в 2,2 раза. Таким образом, опухоль-ассоциированные макрофаги поглощают ЛПВП, метаболизируют их белковый компонент, а кортизол усиливает этот процесс.

Следующим этапом работы явилось изучение роли макрофагов в регуляции скорости биосинтеза белка по включению 14С-лейцина в клетках асцитной карциномы Эрлиха под влиянием ЛПВП и кортизола. Добавление ЛПВП и кортизола к клеткам асцитной карциномы, среди которых содержится 40 % опухоль-ассоциированных макрофагов, приводило к увеличению скорости биосинтеза белка по сравнению с контролем без добавок на 15 %, а по сравнению с культурой клеток карциномы с добавками, но без макрофагов – на 29 % (таблица).

Учитывая антипролиферативный эффект апоЕ, который секретируют макрофаги, и отмеченный нами факт снижения его содержания в опухоль-ассоциированных макрофагах, мы

Скорость биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха

Таблица

Группа и условия инкубации	имп/мин × 103/мг белка, M+m, n=6
1.Клетки карциномы	816,1 ± 14,3
2.Клетки карциномы + ЛПВП + кортизол	937,2 ± 35,4 *
3.Клетки карциномы + апоЕ + ЛПВП + кортизол	733,2 ± 28,3 * #
4.Клетки карциномы без макрофагов + ЛПВП +кортизол	728,1 ± 20,5 * #

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с группой 1 (р<0,05); # – различия статистически значимы по сравнению с группой 2 (р<0,05).

поставили задачу изучить влияние экзогенного апоЕ на скорость биосинтеза белка в опухолевых клетках асцитной карциномы Эрлиха. Добавление хроматографически очищенного апоЕ в концентрации 10 мкг/мл среды к клеткам асцитной карциномы приводило к снижению скорости биосинтеза белка (таблица). Следовательно, апоЕ подавлял эффект комплекса апоA-I-тетрагидрокортизол, образующегося в макрофагах из ЛПВП и кортизола, что согласуется с ранее полученными нами данными об ингибирующем влиянии апоЕ на биосинтез белка в культуре гепатоцитов здоровых крыс [5].

Таким образом, роль макрофагов в регуляции опухолевого роста можно рассматривать с позиции как ингибирующей, так и стимулирующей активности. На наш взгляд, это зависит от того, какая программа реализуется в большей степени: активация синтеза и секреции апоЕ, ингибирующего пролиферацию опухолевых клеток, или поглощение ЛПВП и стероидных гормонов с образованием биологически активного комплекса, усиливающего биосинтез белка в опухолевых клетках.