Роль микрореологических свойств эритроцитов в неньютоновском поведении цельной крови

В системе кровообращения эффективность транспорта существенным образом зависит от реологических свойств крови [1, 4, 22]. Интегральным реологическим показателем является вязкость, которая, в свою очередь, определяется четырьмя основными факторами: 1) вязкостью плазмы; 2) гематокритом; 3) агрегацией; 4) деформируемостью эритроцитов [12, 14]. Два последних фактора относятся к микрореологическим свойствам эритроцитов [9, 16] и в значительной степени определяют эффективность кровотока на уровне микрососудов [3, 8, 18]. Способность эритроцитов формировать агрегаты по типу «монетных столбиков» при замедлении кровотока [11] и их потоковая деформация при высоких скоростях сдвига придают крови свойства неньютоновской жидкости [2, 5, 12]. Выраженное проявление неньютоновских свойств крови негативно сказывается на ее транспортном потенциале из-за возрастающего в этих условиях сопротивления кровотоку [9, 22].

Учитывая вышесказанное, целью настоящего исследования было изучение вклада деформируемости эритроцитов в текучесть цельной крови и суспензии эритроцитов и их неньютоновских свойств.

Материал и методы исследования

Цельную кровь получали венопункцией. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием (20 мин при 3000 об/мин). Затем эритроциты отмывали трижды в холодном изотоническом растворе NaCl, содержавшем глюкозу (5 мМ). Эритроциты делили на четыре аликвоты и клетки инкубировали: 1) с пентоксифиллином (0,02 мг/мл, ингибитор активности фосфодиэстераз в клетках) в течение 15 мин при 37º С; 2) с верапамилом (2,5 мкг/мл, блокатор мембранных кальциевых каналов); 3) с клотримазолом (10 мг/мл, ингибитор активности кальций–зависимых К⁺ каналов мембраны эритроцитов); 4) только с изотоническим раствором NaCl – это был контроль для клеток, инкубированных с препаратами. После периода инкубации (в течение 15 мин при 37º С) готовили суспензии эритроцитов в изотоническом растворе для последующего измерения вязкости и степени деформации клеток в микрокамере при шести уровнях напряжения сдвига: от 0,112 до 1,12 Н ⋅ м^–2.

Деформируемость эритроцитов

Деформируемость эритроцитов исследовали двумя методами:

• 1)    регистрировали вязкость суспензий эритроцитов с гематокритом 40% ( Hct ) на полуавтоматическом капиллярном вискозиметре при шести напряжениях сдвига (от 0,20 до 2,00 Н ⋅ м^–2). Все измерения выполнены при комнатной температуре. Вязкость суспензионной среды (изотонический раствор NaCl с 5,0 мМ глюкозы) была постоянной и составила 1,10 мПа ⋅ с. Коэффициент вариации при измерении вязкости был менее 1,0%;

• 2)    определяли индекс удлинения эритроцитов (ИУЭ) [4] в проточной микрокамере (рис. 1 и 2). Ее заполняли суспензией эритроцитов (0,5%) в изотоническом растворе NaCl, содержащем 5,0 мМ глюкозы и 0,1% человеческого альбумина, и помещали на предметный столик микроскопа. В микрокамеру подавали давление, которое создавало в ней определенную величину напряжения сдвига (длина микрокамеры – 3,5 см, ширина – 0,95 см, высота – 120 мкм). Величина напряжения сдвига ( τ ) в камере рассчитывалась по формуле [7]

τ = 6 η Q / Wh ²,

Рис. 1. Схема проточной микрокамеры для регистрации степени деформации эритроцитов в сдвиговом потоке

ИУЭ = ( L – W )/( L + W )

в

а

б

Рис. 2. Эритроцит, закрепленный одной точкой и деформированный в сдвиговом потоке (τ = 0,56 Н⋅м–2): а – недеформированный эритроцит до приложения сдвигового напряжения; б – деформированный эритроцит, закрепленный одной «точкой» к дну микрокамеры при помощи альбуминового «мостика»; в – схема расчета индекса удлинения деформированного эритроцита, где L – длина вытянутой клетки, W – ширина вытянутого эритроцита где η – вязкость суспензии (примерно – 1,10 мПа⋅с), Q – объемная скорость в микрокамере, W – ширина проточного канала микрокамеры, h – высота канала, равная толщине прокладки (полиэтиленовая пленка около 120 мкм).

Гематокрит определяли путем центрифугирования на гематокритной центрифуге ( ELMI CM -70). Регистрировали степень агрегации эритроцитов с помощью агрегометра типа Myrenne (Германия). При этом получали четыре индекса агрегации (агрегация после движения пробы с высокой скоростью сдвига 600 с^–1 и низкой – 3 с^–1). Статистическую обработку цифрового материала проводили, используя табличный редактор Microsoft Excel .

Результаты исследования

Регистрация вязкости показала, что кривая сдвигового течения суспензии эритроцитов ( Hct = 40%), построенная по шести экспериментальным точкам, практически полностью соответствует математической модели y = ах^–n , достоверность презентации экспериментальных данных ( R ²) составила 0,994 (рис. 3). Таким образом, течение суспензии эритроцитов при концентрации клеток в ней 40% хорошо описывается степенным законом неньютоновской жидкости [5].

При анализе течения эритроцитов, помещенных в изотонический раствор и в собственную плазму, было установлено, что степень неньютоновости более выражена в суспензии с плазмой (рис. 4, а и б ). На это указывают показатель консистенции жидкости ( а ), полученный из уравнения степенного закона течения жидкости [5]: y = ax^–n , а также показатель степени ( n ), величина которого тоже характеризует неньютоновское поведение жидкости. Необходимо еще раз подчеркнуть, что изменения вязкости суспензии как в изотоническом растворе, так и в плазме хорошо описываются моделью жидкости степенного вида с достоверностью аппроксимации данных 0,970–0,980 (см. рис. 4, а и б ). Показатель консистенции составил 3,45 для течения суспензии эритроцитов в собственной плазме. Это было на 24% больше, чем для суспензии клеток в изотоническом растворе. Показатель степени в уравнении течения суспензии в плазме был заметно больше и составил 0,341, тогда как для суспензии в изотоническом растворе он был равен 0,234, что на 33% меньше.

а                                        б

Рис. 4. Изменение вязкости цельной крови при разных напряжениях сдвига ( а ); суспензии эритроцитов ( Hct = 40%) в изотоническом растворе ( б )

Оценить степень неньютоновости можно на основе разницы вязкостей цельной крови или суспензии эритроцитов, измеренных при высоких ( η в выше 100 с^–1) и низких скоростях сдвига ( η н ниже 10 с^–1), при этом расчет производится следующим образом: ИН = [( η н – η в )/ η в ], где ИН – индекс неньютоновости [9]. Для цельной крови (где проявляется феномен агрегации эритроцитов) он был в среднем равен 0,341 ± 0,026, тогда как для суспензии в изотоническом растворе хлорида натрия (отсутствует агрегация эритроцитов) – 0,234 ± 0,012, разница достигла 31%.

Анализируя течение цельной крови или суспензии в аутологичной плазме (при физиологических величинах гематокрита в среднем 40%) при разных напряжениях сдвига, необходимо иметь в виду, что при низких напряжениях на вязкость оказывает существенное влияние обратимая агрегация эритроцитов [12, 22], а в зоне высоких скоростей сдвига снижение вязкости наблюдается вследствие потоковой деформации эритроцитов (рис. 5).

0,3

5 0,25

я о 0,2

I 0,15 я

0,1

0,05

Рис. 5. Кривая течения суспензии эритроцитов в плазме. Вставками на рисунке показаны агрегация (зона низких скоростей сдвига, η н < 10 c^–1) и деформация эритроцитов в зоне течения с высокими скоростями ( η в > 100 c^–1)

y = 0,3088 x ^+0,0696   А

R ² = 0,986

ti i>

К н

0,5

0,45 0,4 0,35 0,3

0,25 m

0,2 0,15 0,1 0,05

y = 0,2793 x ^{+ 0,1219} R ² = 0,955

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Напряжение сдвига, Н/м2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1    1,2

Напряжение сдвига, Н/м2

а

б

Рис. 6. Показатели текучести суспензии эритроцитов (величина, обратная вязкости) ( а ) и          индекса удлинения эритроцитов ( б ) при шести напряжениях сдвига

Рис. 7. Изменение степени удлинения эритроцитов в проточной микрокамере при увеличении приложенного напряжения сдвига. Микрофото: объектив – × 40, окуляр – цифровая камера ( DCM -500)

Если сравнить два графика (рис. 6): зависимость вязкости суспензии эритроцитов, измеренной при шести величинах напряжения сдвига ( а ), и изменение индекса удлинения эритроцитов (ИУЭ) при тех же величинах напряжения ( б ), то видно их сходство. Эта зависимость хорошо описывается уравнением линейной регрессии (см. рис. 6).

Изменение деформируемости отдельных эритроцитов с нарастанием напряжения сдвига хорошо иллюстрирует рис. 7.

Влияние биологически активных веществ на проявление механических свойств эритроцитов

Результаты исследования показали, что при инкубации эритроцитов с неселективным ингибитором фосфодиэстераз (пентоксифиллином) происходит заметное снижение вязкости суспензии эритроцитов на 11% и существенный прирост ИУЭ (на 24%, p < 0,05; таблица).

Изменение вязкости суспензий эритроцитов и индекса их удлинения (ИУЭ) под влиянием инкубации клеток с пентоксифиллином, верапамилом и клотримазолом ( M ± m )

Показатель	Контроль	Пентоксифиллин	Верапамил	Клотримазол
η с , мПа· с	3,45 ± 0,08	3,08 ± 0,04*	3,11 ± 0,06*	2,97 ± 0,03*
ИУЭ, отн. ед.	0,210 ± 0,006	0,260 ± 0,004**	0,257 ± 0,006**	0,247 ± 0,005*
ПА, отн. ед.	5,12 ± 0,22	3,58 ± 0,18**	3,48 ± 0,16**	4,72 ± 0,09

Примечания:

η с – вязкость суспензии эритроцитов при высоких напряжениях сдвига ( Hct = 40%);

ИУЭ – индекс удлинения эритроцитов;

ПА – показатель агрегации ( Myrenne aggregometer , индекс М ₅);

* – различия достоверны по сравнению с группой контроля при p < 0,05;

** – различия достоверны при p < 0,01.

При блокировании Са²⁺ каналов эритроцитов при помощи верапамила наблюдали примерно такое же снижение вязкости суспензии (на 10%, p < 0,05) и прирост ИУЭ, как и при инкубации клеток с пентоксифиллином (см. таблицу). Ингибирование кальцийзависимых К⁺ каналов (Гардош-эффект) эритроцитов при помощи клотримазола тоже сочеталось с заметным повышением деформируемости эритроцитов. На это указывало снижение вязкости их суспензий на 14% ( p < 0,05) и прирост ИУЭ на 18% ( р < 0,05). Все три препарата снижали агрегацию эритроцитов, причем после инкубации клеток с пентоксифиллином и верапамилом уменьшение составило 30–32% ( р < 0,01).

Обсуждение результатов

Вискозиметрия суспензий эритроцитов с постоянными величинами гематокрита и вязкости суспензионной среды при отсутствии у изотонического раствора NaCl агрегирующих свойств позволяет регистрировать потоковую деформируемость клеток [6]. Прямая регистрация степени деформации отдельных эритроцитов в проточной микрокамере подтвердила это заключение. Была выявлена заметная отрицательная корреляция между показателем вязкости суспензии и индексом удлинения эритроцитов ( r = –0,830), что свидетельствует о положительной связи текучести и деформации эритроцитов.

Деформируемость эритроцитов определяется тремя факторами: 1) вязкоэластичностью мембраны, 2) цитоплазматической вязкостью и 3) функциональной геометрией клеток [6, 23]. Вязкость цитоплазмы в основном зависит от концентрации гемоглобина в эритроците и мало изменяется в физиологических условиях [18]. Примененный метод регистрации деформируемости эритроцитов с помощью проточной микрокамеры позволяет получить изображение клеток до приложения напряжения сдвига, и, следовательно, имеется возможность оценить состояние формы клеток (например, переход от дискоцита к сфероидной форме). Поскольку она тоже практически не изменялась, то можно предположить, что оба метода исследования эритроцитов (вискозиметрия суспензии клеток и регистрация индекса их удлинения) оценивают мембранную вязкоэластичность. Последний параметр точно отражает деформируемость клеток в целом, и эти данные хорошо и надежно документируются [10, 21]. Вязкопластическое поведение мембран, вероятно, в наибольшей степени ответственно за потоковую деформацию эритроцитов в целом и является основной причиной неньютоновского поведения суспензии эритроцитов. Это проявляется в выраженной тиксотропии не только цельной крови, где возможно влияние распада агрегатов эритроцитов с увеличением сдвига [15], но и в суспензии эритроцитов в изотоническом растворе NaCl, где агрегация отсутствует [9].

Механические свойства эритроцитов могут изменяться под влиянием сигнальных молекул [4]. Несмотря на простоту конструкции зрелого эритроцита, эта клетка сохранила многие элементы сигнальных путей, включая ионные каналы, мембранные рецепторы и ферменты [17]. Cвидетельством участия функциональных микроструктур мембраны клетки в изменениях деформируемости эритроцитов служат опыты с блокированием Са2+ каналов мембраны при помощи верапамила. При этом наблюдали снижение вязкости суспензий эритроцитов и значительный прирост индекса их удлинения. Напротив, при нагружении клеток Са2+ при помощи кальциевого ионофора (А23187) происходило снижение их деформируемости [20]. Поскольку действие Са2+ опосредовано сигнальными молекулами, связанными с плазматической мембраной, а эффекторами являются мембранные белки [19], становится очевидным, что ведущая роль в регуляторных изменениях деформируемости эритроцита в целом принадлежит мембране клетки. Кроме того, результаты инкубации эритроцитов с пентоксифиллином также подтверждают важную роль мембраны в изменении пластичности клетки. Было получено существенное повышение деформируемости эритроцитов после инкубации с пентоксифиллином. Влияние этого препарата на микрореологию эритроцитов, как и других метилксантинов, связывают с ингибированием активности фосфодиэстераз [13]. Вместе с тем необходимо иметь в виду, что снижение активности фосфодиэстераз может стимулировать аденилатциклазу и, в свою очередь, ограничить поступление Са2+ в клетку [20]. Следовательно, можно полагать, что регистрируемое в наших опытах изменение мембранной эластичности, вероятнее всего, связано с ингибированием именно активности Са2+ в клетке, об этом свидетельствовали работы и других авторов [11, 19, 20].

Таким образом, неньютоновское поведение крови существенным образом связано с деформационными свойствами мембраны эритроцитов, и эти механические свойства могут регуляторным образом изменяться под влиянием сигнальных молекул.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант № 09-04-00436-a.