Роль органических кислот и морфоиммуногистохимических изменений эндометрия в патогенезе неразвивающейся беременности

Введение. Охрана здоровья матери и ребенка считается наиболее приоритетным направлением развития современного здравоохранения. Во всех регионах мира наблюдаются тотальное снижение рождаемости и очевидные неудачи в попытках противодействовать потерям беременности и снизить число преждевременных родов. Для изучения причин нарушения репродуктивной функции че- ловека и разработки методов, восстанавливающих фертильность, предпринимаются самые широкомасштабные исследования [1].

В последнее время все репродуктивные потери объединяют в синдром потери плода. Неразвивающаяся беременность (НБ) является составной частью этого синдрома и представляет собой один из патогенетических вариантов невынашивания беременности [1–4].

Частота НБ остается стабильно высокой и составляет 20 % среди беременных женщин с угрозой прерывания [5]. Ситуацию осложняет ухудшающееся общее и репродуктивное здоровье женщин фертильного возраста, которые не способны выносить и родить здорового ребенка.

Среди наиболее частых причин НБ - иммунологические, эндокринные, анатомические и генетические факторы. Хромосомные аномалии эмбриона/плода являются наиболее распространенным фактором развития самопроизвольных абортов: на них приходится около 50 % всех потерь беременности на сроке гестации до 15 нед. Однако примерно 50 % НБ рассматриваются как имеющие невыясненный генез, или идиопатические [6].

По мнению В.Е. Радзинского [1], в основе НБ лежит дисфункция эндометрия. Именно способность эндометрия адекватно реагировать на циклические колебания уровня стероидных гормонов крови приводит к формированию в нем необходимых ультраструктурных изменений для возникновения «окна имплантации» и в конечном результате обеспечивает имплантацию оплодотворенной яйцеклетки, наступление и развитие беременности.

Для диагностики нарушений трансформации эндометрия достоверным методом является морфологическая оценка, включающая в себя гистологический и иммуногистохимический методы [7]. Однако несмотря на многообразие подобных исследований, нового универсального маркера, специфичного только для беременности, выявлено не было.

Являясь неотъемлемой частью системной биологии, метаболомика обладает многочисленными преимуществами по сравнению с традиционными лабораторными исследованиями, поскольку метаболиты являются конечными продуктами клеточных биологических процессов, а их уровни в конечном итоге отражают комплексную реакцию биологической системы [8, 9].

Органические кислоты (ОК) представляют собой особую группу метаболитов, которые привлекают все больший научный интерес. Эти органические соединения являются промежуточными метаболитами цикла Кребса, углеводного обмена, метаболизма кетоновых тел, в-окисления жирных кислот, обмена нейротрансмиттеров и белкового обмена. ОК, определяемые в биологических жидкостях и тканях человека, являются продуктами разложения аминокислот, бактерий и нейротрансмиттеров, которые предоставляют информацию о выработке энергии, метаболизме нейротрансмиттеров, дисбактериозе кишечника, углеводах и белках. Показатели содержания ОК отражают метаболические процессы, связанные с функцией митохондрий, а измененные концентрации являются биологическими маркерами нарушений [10]. Поэтому изменение соотношения органических кислот при НБ, очевидно, будет отражаться и на эндометрии, что позволяет рассматривать органические кислоты в качестве возможных маркеров прерывания беременности и прогностических неудач гестации.

Вышеизложенное стало причиной изучения профиля ОК с помощью сложных методов лабораторной диагностики и оценки иммуногистохимических особенностей эндометрия.

Представленные данные являются нашим первым опытом построения нового направления в клинической протеогеномике, позволяющего расширить информацию о взаимодействии биологических систем организма.

Цель исследования. Определить прогностическую значимость органических кислот в патогенезе НБ.

Материалы и методы. Было обследовано 30 женщин, которые сформировали 2 группы: I основную группу составили 20 женщин с НБ, II контрольную - женщины с физиологически протекающей беременностью, обратившиеся за артифициальным абортом. Диагноз НБ при поступлении устанавливался на основании результатов ультразвукового исследования (УЗИ).

Критериями включения были репродуктивный возраст, НБ, подтвержденная по УЗИ.

Критериями исключения пациенток из исследования явились наличие онкологических заболеваний, пороки развития органов малого таза, антифосфолипидный синдром (АФС) и системные заболевания.

Всем женщинам проводили морфологическое и иммуногистохимическое исследования эндометрия. Для морфологической оценки биоптаты фиксировались в 10 % нейтраль- ном формалине, заливались в парафин по общепринятой методике. Серийные парафиновые срезы окрашивались гематоксилином и эозином по Ван Гизону. Для иммуногистохимических реакций в парафиновых срезах проводили выявление антигенов иммуноперокси-дазным методом двойных антител с авидинбиотиновой меткой по общей методике. Определяли органические кислоты в сыворотке крови и эндометрии методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории «Хромолаб». Анализировали содержание органических кислот в сыворотке крови и эндометрии, связанных с нарушениями обмена жирных кислот, аминокислот, а также являющихся промежуточными метаболитами в цикле Кребса.

Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью пакета модулей STATISTICA® for Windows, Release 6.0 (StatSoft®Inc., США, 2003, серийный номер AXAR802D898511FA). Все полученные показатели у наблюдаемых пациенток были обра- ботаны методами вариационной математической статистики. За критерий достоверности принята величина р=0,05.

Результаты. Большая часть обследованных женщин основной группы находилась в активном репродуктивном возрасте: их средний возраст составил 29,8±5,8 года. Средний возраст женщин контрольной группы был несколько ниже и составил 24,3±3,7 года. По соматическому и акушерскому анамнезу группы были сопоставимы.

При исследовании сыворотки крови не определялись в обеих группах десять органических кислот: этилмалоновая, мевалоновая, 2-гидроксиизокапроновая, фенилмолочная, 2-метил-3-гидроксимасляная, 3-метилглута-ровая, себациновая, сукциновая, N-ацетилас-партамовая и 3-гидрокси-3-метилглутаровая кислоты.

Были выявлены в сыворотке крови, но не имели достоверно значимых различий в исследуемых группах изовалериановая, адипиновая и глутаровая кислоты (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Кислоты Acids	I группа, ммоль/л Group 1, mmol/L	II группа, ммоль/л Group 2, mmol/L	р
Изовалериановая Isovaleric acid	0,18±0,30	0,18±1,20	0,106
Адипиновая Adipic acid	0,1±0,3	0,24±0,50	0,101
Глутаровая Glutaric acid	0,41±0,30	0,03±0,90	0,121

Органические кислоты в сыворотке крови Organic acids in blood serum

В сравниваемых группах достоверно значимые различия имели молочная, пировиноградная, гиппуровая, гидроксифенилмолочная, 4-гидроксифенилуксусная и 4-гидрокси-фенилпировиноградная кислоты (табл. 2).

При исследовании аналогичных показателей в эндометрии не определились ни в одной из исследуемых групп девять органических кислот: 3-гидрокси-3-метилглутаровая, этил- малоновая, 2-гидроксиизокапроновая, фенилмолочная, 2-метил-3-гидроксимасляная, 3-ме-тилглутаровая, себациновая, сукциновая и N-ацетиласпартамовая кислоты.

Не имели достоверных различий глутаровая, адипиновая, изовалериановая, гидроксифенилмолочная, 4-гидроксифенилпировино-градная и мевалоновая кислоты (табл. 3).

Таблица 2

Table 2

Кислоты Acids	I группа, ммоль/л Group 1, mmol/L	II группа, ммоль/л Group 2, mmol/L	р
Молочная Lactic acid	10,01±0,16	8,16±0,24	0,05
Пировиноградная Pyruvic acid	27,71±0,04	34,1±0,4	0,051
Гиппуровая Hippuric acid	0,19±0,80	0,23±0,90	0,052
Гидроксифенилмолочная Hydroxyphenyllactic acid	0,11±0,40	0,17±0,20	0,051
4-гидроксифенилуксусная 4-hydroxyphenyl acetic acid	0,06±0,30	0	0,051
4-гидроксифенилпировиноградная 4-hydroxyphenyl pyruvic acid	0,14±0,70	0,17±0,20	0,002

Таблица 3

Table 3

Кислоты Acids	I группа, ммоль/л Group 1, mmol/L	II группа, ммоль/л Group 2, mmol/L	р
Глутаровая Glutaric acid	0,41±0,30	0,03±0,90	0,121
Адипиновая Adipic acid	0,15±0,30	0,17±0,50	0,201
Изовалериановая Isovaleric acid	0,12±0,60	0,28±6,20	0,126
Гидроксифенилмолочная Hydroxyphenyllactic acid	0,08±0,40	0,05±0,20	0,122
4-гидроксифенилпировиноградная 4-hydroxyphenyl pyruvic acid	0,04±0,70	0,1±0,2	0,131
Мевалоновая Mevalonic acid	0,005±0,200	0,025±0,200	0,112

Органические кислоты в сыворотке крови Organic acids in blood serum

Органические кислоты в эндометрии Organic acids in endometrium

Достоверно значимые различия имели молочная, пировиноградная, 4-гидроксифени-луксусная и гиппуровая кислоты (табл. 4).

При иммуногистохимическом исследова- нии у всех женщин I группы была обнаружена НБ раннего срока с признаками регрессивных изменений 1–2 стадии и хронического эндометрита (рис. 1, 2).

Таблица 4

Table 4

Кислоты Acids	I группа, ммоль/л Group 1, mmol/L	II группа, ммоль/л Group 2, mmol/L	р
Молочная Lactic acid	8,28±0,20	7,57±0,20	0,05
Пировиноградная Pyruvic acid	23,72±0,90	24,6±0,8	0,05
4-гидроксифенилуксусная 4-hydroxyphenyl acetic acid	0,08±0,30	0	0,05
Гиппуровая Hippuric acid	0,19±0,70	0,13±0,90	0,03

Органические кислоты в эндометрии Organic acids in endometrium

Рис. 1. Регрессивные изменения и признаки хронического эндометрита.

Окраска гематоксилином и эозином (×150)

Fig. 1. Regressive changes and signs of Chronic endometritis. Hematoxylin and eosin stain (×150)

■ строма (%) ■ эпителии (%)

Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование эндометрия у женщин I группы

Fig. 2. Immunohistochemical study of endometrium in women (Group 1)

Обсуждение. Мы обнаружили достоверно значимые изменения в профиле органических кислот у женщин с НБ в сравнении с контрольной группой. Увеличение концентрации молочной кислоты может указывать на сниженную оксигенацию тканей, ишемию и повышенную выработку пировиноградной кислоты, являющейся ключевым этапом метаболизма [11, 12].

Соотношение «лактат/пируват» является показателем окислительно-восстановительного равновесия в клетке, и сдвиг может быть следствием окислительного стресса, дефекта пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК). По данным литературы, в крови здоровых людей величина отношения «пируват/лактат» равна в среднем 10 (9,3–14,3), а ее изменение указывает на нарушение нормального метаболизма [13], что мы и увидели у женщин с НБ.

4-гидроксифенилуксусная кислота является промежуточным продуктом распада в организме человека незаменимой ароматической аминокислоты – фенилаланина, который при окислении превращается в тирозин, являющийся заменимой аминокислотой, участвующей в синтезе белка, в образовании гормонов щитовидной железы, катехоламинов, меланина. В результате нарушения превращения фенилаланина в тирозин образуется дефицит тирозина, дефицит катехоламинов, гормонов щитовидной железы, меланина [14]. Большие концентрации фенилаланина ограничивают транспорт тирозина и триптофана через гематоэнцефалический барьер и тормозят синтез нейромедиаторов. На возможное нарушение превращения фенилаланина в тирозин могут указывать достоверно значимые изменения в концентрациях гиппуровой, гидроксифенилмолочной и 4-гидроксифенилпировино-градной кислот, которые также являются их промежуточными соединениями в процессе катаболизма. Обращает на себя внимание то, что 4-гидроксифенилуксусная кислота определялась только у женщин с НБ.

Выявленные изменения значимо коррелировали с иммуногистохимическими изменениями в эндометрии у женщин с НБ, где была установлена высокая экспрессия маркеров хронического эндометрита HLA-DR, CD16 и CD20 в строме эндометрия и cнижение экспрессии VEGF и маркёра рецептивности LIF в эпителии и строме.

Нами была выявлена прямая корреляция между экспрессией VEGF и содержанием 4-гидроксифенилуксусной и молочной кислот в эндометрии (r=0,41), а также между CD16 и молочной кислотой в эндометрии (r=0,52).

Наши результаты совпадают с данными X. Li et al. [14], подтверждающими, что молочная и пировиноградная кислоты, определяемые в сыворотке крови, могут стать новыми биомаркёрами прогнозирования НБ.

Особо важным для клинициста должно быть понимание того, что в этих условиях возврат к нормальному метаболизму практически невозможен, что, вероятно, и объясняет отсутствие эффективных способов профилактики гестационных потерь на ранних сроках.

Заключение. Результаты нашего исследования позволили сделать вывод, что показатели метаболома в сочетании с иммуногистохимическими особенностями (повышенные уровни экспрессии HLA-DR, CD16, CD20, снижение экспрессии VEGF и LIF) могут служить прогностическими критериями профилактики повторных репродуктивных потерь.

Полученные результаты имеют большое значение, поскольку точное знание адаптивных изменений метаболомного состава биологических жидкостей при НБ позволяет проводить более успешную диагностику возможных осложнений в акушерстве, дифференцировать физиологическую норму и патологические кислотные сдвиги, проводить целенаправленную коррекцию выявленных дефектов.