Роль процессов аутофагии и ангиогенеза при колоректальном раке

Колоректальный рак (КРР) является одной из самых распространенных злокачественных опухолей, занимая в Российской Федерации 3-е место в структуре онкологической заболеваемости, что составляет 10 % от всех случаев злокачественных новообразований. Самая высокая заболеваемость колоректальным раком отмечается в США, Канаде, странах Западной Европы и России. Менее выражен рост темпов заболеваемости в странах Азии и Африки. По данным литературы, ежегодно диагностируется более 800 тысяч первичных случаев колоректального рака и более 440 тысяч летальных исходов по всему миру [1–3].

Прогноз и тактика лечения при колоректальном раке во многом зависят от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли. Однако даже в пределах клинически однородных групп пациентов КРР характеризуется гетерогенным течением и неодинаковым ответом на терапию. Подобное явление связывают с тем, что среди схожих морфологических вариантов опухолей можно выделить несколько молекулярно-биологических субтипов, значительно различающихся по своему молекулярному патогенезу [4].

На основании анализа литературы, опубликованной за последние годы, можно сделать вывод, что молекулярно-биологические свойства опухоли при КРР являются основой лечения этой патологии. Крайне актуальным является изучение процессов аутофагии и ангиогенеза в опухоли, а также молекулярно-биологических маркеров, взаимосвязанных с ними. Аутофагия представляет собой катаболический процесс, который характеризуется клеточным самоперевариванием и удалением избыточных, долгоживущих или дисфункциональных органелл и белков. Выделяют три морфологические формы аутофагии: макроаутофагия, микроаутофагия и шаперон-опосредованная аутофагия. Макроаутофагия характеризуется наличием двойных мембранных везикул, известных как аутофагосомы, которые захватывают компоненты цитоплазмы и доставляют их в лизосомы для дальнейшего переваривания. При микроаутофагии макромолекулы захватываются самой лизосомой.

Третий тип, шаперон-опосредованная аутофагия, подразумевает направленный транспорт белков и других макромолекул из цитоплазмы в полость лизосомы для дальнейшего их переваривания с помощью лизосомальных гидролаз [5].

После аутофагической деструкции внутриклеточный материал удаляется из лизосомального комплекса, и происходит его рециркуляция в цитоплазме [6]. Ряд исследований убедительно показали, что процессы аутофагии наиболее выражены в злокачественных опухолях, вызванных мутациями генов семейства RAS. Особенно активная аутофагия наблюдается в зонах опухоли, где трансформированные клетки испытывают состояние гипоксии, что может рассматриваться как защитный процесс, позволяющий поддерживать жизнедеятельность опухолевых клеток [7].

Аутофагия является важным этапом на пути трансформации здоровых клеток в злокачественные. Точные механизмы, приводящие к запуску процессов аутофагии в раковых клетках, еще не полностью изучены. С одной стороны, аутофагия – это способ контроля, используемый нормальными клетками, защищающий их от превращения в злокачественные. Данный механизм осуществляется путем удаления поврежденных органелл и продуктов обмена, а также уменьшения количества активных форм кислорода. С другой стороны, аутофагия может способствовать формированию и росту опухоли, помогая обеспечивать клетку питательными веществами, что имеет решающее значение для метаболизма и роста трансформированных клеток [8]. Так, в условиях дефицита питательных веществ или при других стрессовых состояниях аутофагия обеспечивает клетку незаменимыми аминокислотами и энергией для синтеза белка [9]. Кроме того, аутофагия позволяет клеткам выжить путем ингибирования апоптоза и повышения резистентности к лекарственным средствам. F. Burada et al. показали, что раковые клетки, выделенные из опухолей с подавленными процессами аутофагии, были менее резистентны к экзогенным факторам, чем их аналоги с нормально протекающими процессами аутофагии. Таким образом, опухоли с дефицитом аутофагии становятся более чувствительными к химиотерапевтическим агентам и лучевой терапии [10].

Процессы аутофагии регулируются множеством генов, такими как LC3, Beclin-1, p62 и 51-подобная киназа 1 (ULK1), которые являются основными маркерами, связанными с аутофагией. Наиболее изученными белками являются LC3 и Beclin-1 [11]. LC3 является точно установленным маркером аутофагии в раковых клетках и белком, предположительно вовлеченным в процессы развития колоректального рака человека [12]. Гиперэкспрессия LC3-II наблюдается в клетках опухолей, особенно на поздних стадиях [13]. Отличительной чертой формирования аутофагосомы с участием LC3

является введение данного белка в пространство между внутренним и наружным слоями формируемой везикулы.

Beclin-1 – это белок, также специфичный для процесса аутофагии, который регулирует образование аутофагосом [12]. Среди всех связанных с аутофагией белков Beclin-1 является ключевым регулятором этого процесса [14]. Beclin-1 взаимодействует с несколькими связывающими белками и может как индуцировать, так и подавлять аутофагический путь. До недавнего времени ген BECN1, кодирующий белок Beclin-1, был известен в качестве гена-супрессора опухоли. Тем не менее текущие исследования не выявили доказательств мутации BECN1 или потери данного гена при злокачественных новообразованиях, за исключением рака молочной железы и яичников [15]. Доказано, что дисфункция Beclin-1 связана с рядом иммунных расстройств, нейродегенеративными заболеваниями и раком [16]. Данные Cancer Genome Atlas Research Network показывают, что только 2,5 % колоректального рака сопровождаются генетическими изменениями гена BECN1. Не до конца изученным остается вопрос о локализации Beclin-1 в клетке. Полагают, что данный белок находится главным образом в цитозоле, однако в некоторых исследованиях была продемонстрирована как ядерная, так и цитоплазматическая локализация Beclin-1 [17].

S. Wu et al. исследовали экспрессию трех белков, связанных с аутофагией (Beclin1, LC3 и mTOR), у пациентов с колоректальным раком. Было показано, что экспрессионные показатели LC3 и mTOR могут быть использованы как прогностические маркеры для оценки выживаемости при КРР [18]. Установлено, что эти белки расположены главным образом в цитоплазме клеток, и их экспрессия значимо выше в опухолевых клетках, чем в здоровых. Показатели экспрессии LC3 оказались связаны с дифференцировкой клеток, а mTOR – также с параметрами лимфогенного метастазирования. Кроме того, повышенная экспрессия LC3 и сниженная экспрессия mTOR были связаны с выживаемостью пациентов с КРР [16].

ULK1/Atg 1 представляет собой серин/трео-нинкиназу, которая необходима для процесса аутофагии и раннего образования аутофагосом у млекопитающих [19, 20]. Данные о роли этих белковых молекул в патогенезе онкологических заболеваний крайне ограничены. Тем не менее считается, что изменение экспрессии ULK1/Atg 1 носит прогностический характер при некоторых злокачественных новообразованиях, но для большинства опухолей связь прогноза и выраженности экспрессии данного маркера не установлена [21]. Так, известно, что высокая экспрессия ULK 1 при плоскоклеточном раке пищевода связана с неблагоприятным прогнозом заболевания [21]. В то же время для рака молочной железы связь экспрессии данного маркера с прогнозом, по данным разных авторов, противоречива. Ряд источников связывают гиперэксперссию ULK 1 с неблагоприятным прогнозом, другие авторы, наоборот, отождествляют низкую экспрессию ULK1 с опухолевым ростом [22, 23]. Несмотря на то, что роль ULK1/Atg1 в процессах опухолевой прогрессии остается не до конца изученной, тем не менее принято считать, что гиперэкспрессия данного опухолевого маркера может играть значимую роль в онкогенезе [19].

P62 – адаптерный белок, основной функцией которого является сборка белковых комплексов. P62 участвует в нескольких важных сигнальных путях в клетке. Кроме того, p62 играет существенную роль в регуляции апоптоза, путем активации полиубиквитинированной каспазы 8, и влияет на окислительные стрессы.

Недостаточно изучено влияние ключевых белков аутофагии на химиорезистентность клеток колоректального рака. K.J. Schmitz et al. [12], исследуя потенциальную прогностическую ценность белков Beclin-1, p62, LC3 и ULK1 в образцах КРР, установили, что снижение экспрессии p62 в цитоплазме опухолевых клеток прямо коррелирует с неблагоприятным течением заболевания и повышением химиорезистентности клеток КРР. Был проведен иммунногистохимический анализ экспрессии белков LC3, p62, Beclin-1 и ULK1, который выявил, что в клетках опухолевой ткани белки P62 и Beclin-1, содержащиеся в цитоплазме и в ядре, окрашиваются с различной частотой, в зависимости от своей локализации в клетке. При этом важно отметить, что в нормальной ткани слизистой оболочки кишечника из образца дивер-тикулеза иммуногистохимическое окрашивание с антителами к p62 и LC3 отсутствовало. Согласно результатам исследования, из 126 изученных опухолей КРР 15 (11,9 %) классифицированы как цитоплазматические р62-отрицательные, остальные 111 (88,1 %) обозначены как цитоплазматические р62-положительные [12]. Установлены, по крайней мере, два механизма работы белка p62, которые могут объяснить агрессивное течение p62-отрицательного колоректального рака:

• 1)    р62 может действовать как супрессор опухолей, поскольку он способен индуцировать аутофагическую деградацию регуляторов сигнального пути Wnt [24];

• 2)    отсутствие cdk1-опосредованного фосфорилирования р62 приводит к усиленной клеточной пролиферации. Таким образом, снижение экспрессии белка р62 может привести к более быстрому выходу клетки из процесса митоза, что приводит к ускоренному клеточному делению [25].

По данным K.J. Schmitz et al., наличие белков Beclin-1 и LC3 в ядре также было связано с уменьшением чувствительности опухолевых клеток КРР к химиотерапии, но исключительно в подгруппе клеток с мутациями генов KRAS. Было также вы- явлено, что экспрессия ULK-1 не была связана с прогнозом при колоректальном раке [12].

В последнее время все больший интерес вызывает возможность использовать моноклональные антитела против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в терапии колоректального рака. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) признан важным посредником в возникновении и прогрессировании КРР. Однако довольно быстро было установлено, что некоторые КРР (по неопределенным причинам) оказались резистентными к терапии anti-EGFR [26].

Z. Chen et al. при изучении влияния aEGFR на клетки колоректального рака in vitro установили, что рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) играет ключевую роль в инициировании, прогрессировании, росте и развитии метастазов колоректального рака. aEGFR дозозависимо активирует Beclin-1 в двух клеточных линиях КРР – HT29 и SW480. Авторы делают вывод о том, что aEGFR может снижать уровень микро-РНК в клетках колоректального рака, что впоследствии активирует Beclin-1 и увеличивает аутофагию опухолевых клеток, чтобы предотвратить их aEGFR-опосредованную гибель [27]. Таким образом, активация процессов, которые позволят повысить уровни микро-РНК и ингибировать клеточную аутофагию, может потенциально улучшить результаты лечения КРР с помощью aEGFR.

Роль микро-РНК (miRNA) в жизнедеятельности клеток опухолевой ткани рассматривается и в других исследованиях. Микро-РНК представляют собой класс некодирующих небольших РНК, которые регулируют перенос белка мРНК. Имеются данные, свидетельствующие о том, что miRNA играют важную роль в росте опухолевых клеток [28, 29]. В частности, ингибитор Beclin-1, MicroRNA-30a (miR-30a), участвует в большинстве клеточных процессов, включая транскрипцию мРНК и трансляцию белка. Известно, что связывание miR-30a с Beclin-1 ингибирует экспрессию Beclin-1 в раковых клетках [30]. L. Liu et al. при исследовании экспрессии miR-30a в ткани колоректального рака показали, что уровень этого маркера в опухоли был значительно ниже, чем в здоровых тканях, и обратно коррелировал с уровнем белка Beclin-1. Это явление указывает на то, что аутофагия активируется в тканях КРР, что может быть вызвано уменьшением miR-30a [10].

Ангиогенез представляет собой сложный процесс, в ходе которого образуются новые кровеносные сосуды из эндотелиального предшественника, что является ключевым фактором в развитии опухолевой ткани. Установлено, что рост опухоли и распространение метастазов главным образом зависят от двух сигнальных молекул: сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) [31, 32]. Открытие этих молекулярных маркеров стало основой для разработки лекарственных препаратов, ингибирующих опухолевый ангиогенез. Наиболее эффективными оказались анти-VEGF-агенты, которые являются препаратами выбора для лечения метастазов колоректального рака. У больных КРР с низким уровнем экспрессии генов VEGFA, VEGFR1 и VEGFR-2 (изоформы VEGF) выше средняя безрецидивная выживаемость, и они значительно лучше поддаются лечению ингибиторами ангиогенеза, чем пациенты с высокой экспрессией этих генов [33–36].

Особого внимания в качестве маркера ангиогенеза заслуживает микроРНК. Недавние исследования показали, что miRNA могут модулировать ангиогенез опухоли посредством воздействия на проантиангиогенные факторы, включая RTK-сигнальный белок, HIF, VEGF и EGF [37]. Наибольший интерес представляет изоформа miRNA-126, высокая экспрессия которой связана с усилением передачи сигналов VEGF-A в эндотелиальных клетках [38]. Наличие miRNA-126 является благоприятным прогностическим признаком. При КРР с выраженной экспрессией данного маркера выше показатели 5-летней выживаемости [37].

Известен еще один маркер ангиогенеза – ТЕМ, который продуцируется злокачественными клетками и является маркером эндотелия опухоли [39]. B. St Croix et al. впервые сравнили экспрессию