Роль протеинкиназы С, ERK-киназы, NO-синтазы и КАТФ-каналов в механизме антиаритмического действия опиоида U-50,488 при кратковременной ишемии и реперфузии сердца in vivo

Несмотря на повсеместное применение у больных инфарктом миокарда антиаритмических препаратов I– IV класса, частота возникновения потенциально злокачественных желудочковых аритмий составляет 41% [4]. Этот факт свидетельствует об актуальности поиска новых антиаритмических средств, принципиально отличных от тех, которые сегодня применяются в клинической практике. Одним из таких потенциальных антиарит-мических препаратов является селективный агонист κ1-опиоидных рецепторов (ОР) U-50,488. Ранее нами было показано, что стереоизомер (-)-trans-(1S,S)-U-50,488, обладающий высоким сродством к κ1-ОР, оказывает выраженный антиаритмический эффект на модели кратковременной ишемии (10 мин) и реперфузии (10 мин) сердца in vivo [5]. В то же время стереоизомер (+)-trans-(1R,2R)-U-50,488, проявляющий низкое сродство к κ1-ОР, не влиял на частоту возникновения ишемических и реперфузионных аритмий [5]. Эти данные мы расценили как косвенное доказательство участия опиоидных рецепторов в антиаритмическом эффекте (-)-trans-(1S,S)-U-50,488. Дальнейшие эксперименты показали, что анти-аритмический эффект U-50,488 на модели коронароок-клюзии и реперфузии является следствием активации периферических κ1-ОР [2, 3]. Вместе с тем сигнальный механизм антиаритмического действия U-50,488 оставался не ясным. Известно, что в механизме кардиопротектор-ного действия фармакологических агентов, повышающих устойчивость сердца к действию ишемии-реперфузии, важную роль играют протеинкиназа С [6, 14], ERK-киназа (extracellular-signal regulated kinase) [16], NO-синтаза [14] и КАТФ-каналы [11, 14]. Опираясь на эти литературные данные, мы предположили, что в механизме антиаритмичес-кого действия U-50,488 могут быть задействованы названные ферменты и КАТФ-каналы.

Цель работы: изучить роль протеинкиназы С, ERK-киназы, NO-синтазы и КАТФ-каналов в механизме анти- аритмического действия опиоида U-50,488 при кратковременной ишемии и реперфузии сердца in vivo.

Материал и методы

Эксперименты проведены на крысах линии Вистар массой 250–280 г. Для моделирования коронароокклю-зии крысы были наркотизированы с помощью внутрибрюшинного введения α -хлоралозы в дозе 50 мг/кг. В ходе всего последующего эксперимента через интубационную трубку осуществляли искусственную вентиляцию легких с помощью модифицированного аппарата “РО-6” (ОАО “Красногвардеец”, Санкт-Петербург, Россия). Правую сонную артерию канюлировали для измерения артериального давления (АД), которое регистрировали с помощью датчика давления SS13L (“Biopac System Inc.”, Goleta, Калифорния, США), сопряженного с аппаратом для электрофизиологических исследований MP35 (“Biopac System Inc.”, Goleta, США). Этот же аппарат был использован нами для записи ЭКГ. Количественную обработку полученных данных осуществляли с помощью программного обеспечения INSTBSL-W фирмы-производителя.

Ишемию (10 мин) и реперфузию (10 мин) миокарда воспроизводили по методике J.E. Schultz и соавт. [15]. Запись ЭКГ осуществляли непрерывно на протяжении ишемии и реперфузии с помощью аппарата для электрофизиологических исследований MP35 (“Biopac System Inc.”, Goleta, США).

Селективный агонист κ ₁-опиоидных рецепторов (-)-U-50,488 (trans(-)-3,4-Dichloro-N-methyl-N-[2-(1-pyrrolidinil)cyclohexyl] benzenacetamode hydrochloride) вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг за 15 мин до перевязки коронарной артерии [1]. Блокатор АТФ-чувствитель-ных К⁺-каналов (К_АТФ-каналов) глибенкламид вводили внутривенно в дозе 0,3 мг/кг за 45 мин до коронароок-клюзии [15]. Ингибитор NO-синтазы L-NAME (N^G-nitro-L-arginine methyl ester) вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг за 25 мин до ишемии [12]. Ингибитор протеин-киназы С хелеритрин вводили внутривенно в дозе 5 мг/кг за 20 мин до корона-роокклюзии. Внутривенную инъекцию ингибитора MEK1/2-киназы и сопряженной с ней ERK1/2-киназы PD98059 (2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one) осуществляли в дозе 0,3 мг/кг [17]. Ингибитор сарколеммаль-ных К_АТФ-каналов HMR 1098 (1-[5-[2-(5-chloro-o-anisamido)ethyl]-2-methoxyphenyl]sulfonyl-3 methylthiourea sodium salt) применяли в дозе 3 мг/кг [9].

Глибенкламид и PD98059 предварительно растворяли в 0,1 мл диметилсульфоксида, а затем в 0,9 мл 20%-го раствора гидроксипропил-

β -циклодекстрина, который использовали для внутривенного введения. Хелеритрин, L-NAME, HMR 1098 и (-)U-50,488 растворяли в 0,9%-м растворе NaCl. Хелеритрин плохо растворим в воде при комнатной температуре, поэтому физиологический раствор перед растворением хелеритрина предварительно нагревали до +55 °С, а затем охлаждали до +37 °С. Все растворы готовили непосредственно перед использованием. В группу контроля вошли животные, у которых воспроизводили коронаро-окклюзию и реперфузию, а внутривенно вводили 20%-й раствор гидроксипропил- β -циклодекстрина из расчета 1 мл/кг массы тела.

Глибенкламид и гидроксипропил- β -циклодекстрин были закуплены в компании “Sigma-Aldrich” (St. Louis, США), L-NAME – в компании “ICN Biomedicals” (Aurora, США), а хелеритрин и PD98059 – в “LCLabs Company” (Woburn, США). Опиоид (-)-U-50,488 был приобретен в компании “Tocris Bioscience” (Bristol, Великобритания). Ингибитор сарколеммальных К_АТФ-каналов HMR 1098 был синтезирован в компании “Sanofi-Aventis Deutschland GmbH” (Frankfurt, Германия).

Статистическую значимость различий в частоте возникновения желудочковых аритмий между группами оценивали с помощью критерия χ ².

Результаты и обсуждение

Как показано в таблице 1, в группе контроля к арит-могенному влиянию коронароокклюзии была устойчива только одна крыса из 23 особей, частота появления желудочковых экстрасистол составляла 91%, желудочковая тахикардия была обнаружена у 83% животных, а желудочковая фибрилляция была зафиксирована у одной крысы из 23 животных. Реперфузия приводила к возникновению желудочковых аритмий у всех крыс, у 74% крыс была отмечена желудочковая экстрасистолия, а у 87% особей была выявлена желудочковая тахикардия, у 17% животных была зафиксирована желудочковая фибрилляция.

После внутривенного введения (-)-U-50,488 было об-

Таблица 1

Роль оксида азота в антиаритмическом эффекте (-)-U-50,488 при кратковременной ишемии и реперфузии сердца, n(%)

Группы животных	n	БЖА	МЖЭ	ЖТ	ЖФ
Ишемия (10 мин)
Контроль	23	1 (4)	21 (91)	19 (83)	1 (4)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	9 (47)**	10 (59)**	7 (37)**	0 (0)
L-NAME (10 мг/кг)	14	2 (14)	12 (86)	11 (78)	2 (14)
L-NAME (10 мг/кг) + (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	15	2 (13)	11 (73)	10 (67)	0 (0)
Реперфузия (10 мин)
Контроль	23	0(0)	17(74)	20(87)	4(17)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	8 (42)***	10 (53)	8 (42)**	0 (0)
L-NAME (10 мг/кг)	14	1 (7)	11 (78)	10 (71)	3 (21)
L-NAME + (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	15	2 (13)	13 (87)	12 (80)	0 (0)

Примечание: n – количество животных; БЖА – без желудочковых аритмий; МЖЭ – множественные желудочковые экстрасистолы; ЖТ – желудочковая тахикардия; ЖФ – желудочковая фибрилляция. Статистическая значимость различий по отношению к контрольной группе: * – p<0,05; ** – р<0,01; *** – р<0,001. Препараты вводили внутривенно в следующих дозах: (-)-U-50,488 (1 мг/кг); L-NAME (10 мг/кг).

наружено повышение толерантности сердца к действию ишемии-реперфузии. Девять из 19 животных были устойчивы к аритмогенному влиянию коронароокклю-зии, только у 10 из 19 крыс была зафиксирована желудочковая экстрасистолия, в 2 раза снижалась частота возникновения желудочковой тахикардии, не было ни одного случая появления фибрилляции желудочков. Сходная картина наблюдалась при 10-минутной реперфузии. В этом случае инъекция (-)-U-50,488 способствовала появлению толерантности к аритмогенному влиянию реперфузии у 42% особей, достоверно снижалась частота возникновения желудочковой экстрасистолии, в 2 раза снижалась частота появления желудочковой тахикардии, ни у одной особи не была отмечена фибрилляция желудочков.

Предварительная блокада NO-синтазы с помощью L-NAME устраняла антиарит-мический эффект (-)-U-50,488 как во время ишемии, так и после возобновления коронарной перфузии. Инъекция одного L-NAME не влияла на частоту появления ишемических и реперфузионных аритмий. Эти данные свидетельствуют о том, что NO– участвует в механизме антиаритмического действия (-)-U-50,488. Этот факт согласуется с опубликованными нами ранее данными о том, что антиаритмический эффект другого агониста ОР дельторфина II был связан с активацией NO-синтазы [14].

Как видно из таблицы 2, ингибирование протеинки-назы С (ПКС) хелеритрином полностью устраняет анти-аритмический эффект (-)-U-50,488. Инъекция одного хелеритрина не влияла на частоту возникновения окклюзионных и реперфузионных нарушений сердечного ритма. Эти данные согласуются с представлениями о ключевой роли названного фермента в повышении устойчивости сердца к патогенному действию ишемии-реперфузии после ишемического прекондиционирования [3, 18], а также с результатами наших исследований, которые свидетельствуют о том, что ПКС играет важную роль в опиоид-индуцированной толерантности сердца к действию коронароокклюзии [14].

Нами было показано, что препарат PD98059, который

Таблица 2

Вклад протеинкиназы С в антиаритмический эффект стимуляции κ ₁-опиоидных рецепторов при кратковременной ишемии и реперфузии, n(%)

Группы животных	n	БЖА	МЖЭ	ЖТ	ЖФ
Ишемия (10 мин)
Контроль	23	1 (4)	21 (91)	19 (83)	1 (4)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	8 (42) ***	10 (53) ***	8 (42)***	0 (0)
Хелеритрин (5 мг/кг)	14	3 (21)	9 (64)	5 (36)	1 (7)
Хелеритрин (5 мг/кг) + (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	14	3 (21)	8 (57)	9 (64)	1 (7)
Реперфузия (10 мин)
Контроль	23	0 (0)	17 (74)	20 (87)	4 (17)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	6 (43) ***	7 (50) **	5 (36)***	0 (0)
Хелеритрин (5 мг/кг)	14	1 (7)	11 (79)	9 (64)	2 (14)
Хелеритрин (5 мг/кг) + (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	14	0 (0)	12 (86)	14 (100)	1 (7)

Примечание: n – количество животных; БЖА – без желудочковых аритмий; МЖЭ – множественные желудочковые экстрасистолы; ЖТ – желудочковая тахикардия; ЖФ – желудочковая фибрилляция. Статистическая значимость различий по отношению к контрольной группе: * – p<0,05; ** – p<0,025; *** – р<0,01.

Таблица 3

Вклад MEK1/2-киназы и сопряженной с ней ERK1/2-киназы в антиаритмический эффект стимуляции κ ₁-опиоидных рецепторов при кратковременной ишемии и реперфузии, n(%)

Группы животных	n	БЖА	МЖЭ	ЖТ	ЖФ
Ишемия (10 мин) Контроль	23	1 (4)	21 (91)	19 (83)	1 (4)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	8 (42) ***	10 (53) ***	8 (42) ***	0 (0)
PD98059 (0,3 мг/кг) + (-)-U-50488 (1 мг/кг)	12	9 (75)***	3 (25)***	1 (8)***	0 (0)
Реперфузия (10 мин) Контроль	23	0 (0)	17 (74)	20 (87)	4 (17)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	6 (43) ***	7 (50) **	5 (36)***	0 (0)
PD98059 (0,3 мг/кг) + (-)-U-50488 (1 мг/кг)	12	10 (83)***	2 (17)***	0 (0)***	0 (0)

Примечание: n – количество животных; БЖА – без желудочковых аритмий; МЖЭ – множественные желудочковые экстрасистолы; ЖТ – желудочковая тахикардия; ЖФ – желудочковая фибрилляция. Статистическая значимость различий по отношению к контрольной группе: * – p<0,05; ** – p<0,025; *** – р<0,01.

является ингибитором MEK1/2-киназы и сопряженной с ней ERK1/2-киназы, не влияет на антиаритмический эффект (-)-U-50,488 (табл. 3). Сам PD98059 не изменяет устойчивость сердца к аритмогенному влиянию ишемии и реперфузии. Этот факт оказался для нас несколько неожиданным, поскольку в литературе распространено мнение, что инфаркт-лимитирующий эффект опиоидов связан с активацией ERK1/2-киназы [8, 10, 13]. Вместе с тем в литературе отсутствуют данные об участии ERK1/2-ки-назы в механизме антиаритмического действия опиоидов. Вполне вероятно, что в реализации антиаритмичес-кого и кардиопротекторного действия опиоидов принимают участие различные сигнальные механизмы.

Как показано в таблице 4, неселективный блокатор КАТФ-каналов глибенкламид полностью устраняет анти-аритмический эффект (-)-U-50,488. В то же время селективный ингибитор сарколеммальных КАТФ-каналов HMR 1098 не влияет на (-)-U-50,488-индуцированное повышение толерантности сердца к аритмогенному действию ишемии-реперфузии. Введение одного глибенкламида или одного HMR 1098 не влияло на частоту возникновения окклюзионных и реперфузионных аритмий (табл. 1). Эти данные согласуются с результатами исследований R.M. Fryer и соавт. [9], которые показали, что антиаритмический эффект агониста δ1-опиоидных рецепторов TAN-67 не проявляется в условиях блокады митохондриальных КАТФ-ка-налов 5-гидроксидеканоатом, но сохраняется после применения HMR 1098. Эти факты свидетельствуют о том, что антиаритмический эффект (-)-U-50,488 связан с активацией КАТФ-каналов, по-видимому, митохондриальной локализации.

Таблица 4

Вклад К_АТФ-каналов в антиаритмический эффект стимуляции κ 1-опиоидных рецепторов при кратковременной ишемии и реперфузии сердца

Группы животных	n	БЖА	МЖЭ	ЖТ	ЖФ
Ишемия (10 мин)
Контроль	23	1 (4)	21 (91)	19 (83)	1 (4)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	8 (42)**	10 (53) **	8 (42)**	0 (0)
Глибенкламид (0,3 мг/кг)	14	1 (7)	12 (86)	11 (78)	1 (7)
HMR 1098 (3 мг/кг)	14	2 (14)	11 (78)	10 (71)	0 (0)
Глибенкламид (0,3 мг/кг) + (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	14	3 (21)	10 (71)	9 (64)	0 (0)
HMR 1098 (3 мг/кг) + (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	14	7 (50) **	7 (50) **	8 (57)	0 (0)
Реперфузия (10 мин)
Контроль	23	0 (0)	17 (74)	20 (87)	4 (17)
(-)-U-50,488 (1 мг/кг)	19	6 (32) **	7 (37)*	5 (26) ***	0 (0)
Глибенкламид (0,3 мг/кг)	14	1 (7)	13 (93)	11 (78)	1 (7)
HMR 1098 (3 мг/кг)	14	2 (14)	11 (78)	9 (64)	1 (7)
Глибенкламид (0,3 мг/кг) + (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	14	2 (14)	10 (71)	10 (71)	1 (7)
HMR 1098 (3 мг/кг)+ (-)-U-50,488 (1 мг/кг)	14	7 (50)***	7 (50)	5 (36)**	0 (0)

Примечание: n – количество животных; БЖА – без желудочковых аритмий; МЖЭ – множественные желудочковые экстрасистолы; ЖТ – желудочковая тахикардия; ЖФ – желудочковая фибрилляция. Статистическая значимость различий по отношению к контрольной группе: * – p<0,025; ** – p<0,01; *** – p<0,001.

Заключение

Селективный агонист κ ₁-опиоидных рецепторов (-)-U-50,488 повышает толерантность сердца к аритмоген-ному влиянию кратковременной ишемии-реперфузии за счет активации NO-синтазы, протеинкиназы С и открытия К_АТФ-каналов. Киназы MEK1/2 и ERK1/2 не участвуют в реализации антиаритмического эффекта (-)-U-50,488.

Работа выполнена при поддержке РФФИ и Министерства образования и науки Российской Федерации (гос. контракт № 11.519.11.2028).