Роль серотонина в половом созревании на модели D. gyrociliatus

Серотонин (5-НТ) – ключевой регулятор многих процессов жизнедеятельности и размножения в частности. Существует два принципиальных способа воздействия серотонина на клетки: либо через систему мембранных рецепторов [16], либо через посттрансляционные модификации белков, посредством серотонилирования [20]. 5-НТ является лигандом для семи типов рецепторов, воздействуя на которые он запускает внутриклеточные сигнальные каскады и активирует межклеточные взаимодействия [12, 16]. Изучение механизма действия в большинстве работ связано с поиском агонистов или антагонистов рецепторов, их биохимической и фармакологической характеристикой.

Х.С. Коштоянц предположил, что нейромедиаторы могут действовать не только через систему мембранных рецеп- торов, но и как метаболические внутриклеточные агенты. В последние годы это предположение получило экспериментальные подтверждения. Так, было показано, что транспорт серотонина в клетку через мембрану лежит в основе важнейших сигнальных функций [13, 15], а его присутствие внутри клетки обеспечивает биохимический субстрат для реакции трансамидирования, катализируемой ферментом трансглутаминазой, что приводит к посттрансляционной модификации белков, серотонилированию [20]. Недавно было показано, что серотонилирование также происходит и у беспозвоночных животных [7]. Так было показано серотони-лирование в раннем развитии морского ежа и моллюсков [6].

В настоящей работе в качестве объекта предложена аннелида D. gyrociliatus, обла- дающая коротким циклом развития, и относительной простотой содержания в лабораторной культуре [10, 11]. Ранее была детально изучена серотонинергическая нервная система взрослых особей, а также ее развитие [3-5, 8]. Ювенильные особи имеют размеры 0.5 мм, взрослые особи достигают 1.5-2 мм в длину. Передвижение по субстрату осуществляется с помощью ресничек вентральной ресничной полоски. На теле есть кольцевые ресничные шнуры, обеспечивающие плавание в толще воды и перемещение пищевых частиц. В составе нервной системы выделяют следующие структуры: головной ганглий, окологлоточное нервное кольцо и продольные вентральные стволы, расположенные непосредственно под вентральной ресничной полоской, как у ювенильных, так и у взрослых особей [3, 5, 9]. Серотонин содержится в значительной части ЦНС, в нейронах головного ганглия, в продольных вентролатеральных стволах и прилегающих к ним нейронах.

Кроме того, экспериментально было показано, наличие компонентов системы синтеза и захвата серотонина [2]. Также было установлено влияние серотонина и его предшественника на темпы ресничной локомоции [2].

Целью работы было выявление влияния повышенного и пониженного уровня серотонина, а также пониженного уровня серо-тонилирования белков в развитии модельной аннелиды D. gyrociliatus .

Материалы и методы

Лабораторная культура морских анне-лид содержится на проятжении 15 лет. Взрослые особи содержатся в 200 мл пластиковых контейнерах с морской водой, накрытых крышкой. Кормление и смена воды производятся раз в неделю. В качестве корма используется протертая свежезамороженная крапива.

При проведении первой серии экспериментов от взрослых самок получали свежие кладки на стадии зиготы. Далее кладки разделяли на 4 группы, первую инкубировали в растворе предшественника серотонина (n = 150, НТР, 10-6 М, вторую в парахлорфенилаланине (n = 130, РСРА, 106М), третью в цистамине (n = 105, CYS, 10-

6М), четвертая – контроль (n = 150). Для каждой группы фиксировали сроки вылупления и процент вылупившихся. Во второй серии экспериментов взрослых самок одного возраста (43 дня ) разделяли на четыре группы: первую инкубировали в растворе предшественника серотонина (n= 136, HTP, вторую в парахлорфенилаланине (n = 54, pcpa), третью в цистамине (n = 69, cystamine), четвертая – контроль (n = 96). Икубации взрослых самок продолжались в течение двух недель, меняя раствор раз в 7 дней. От этих самок получали кладки с точной датировкой по времени. После чего наблюдали за кладками и фиксировали момент вылупления и наступления полового созревания, которое оценивалось, как время появления первых кладок у молодых особей.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью программы Graph Pad Prism. В случае сравнения двух групп применяли непарный t-тест. Результаты представлены как среднее ± стадартная ошибка среднего. Разница считалась достоверной при значении p < 0.05.

Результаты

При инкубации в НТР и контроле наблюдается самый высоки процент вылупившихся особей, как в первой серии экспериментов при инкубации эмбрионов (97,33% в контроле и 99% в НТР, соответственно) (Рис. 1А), так и во второй серии при предварительной инкубации матерей (95,83% в контроле и 95,58% в НТР) (Рис. 1Б). При инкубации в РСРА и цистамине (cystamine) процент вылупившихся особей ниже, как в первой серии экспериментов 36,92% в РСРА и 95,73% в цистамине, соответственно (Рис. 1А) при инкубации эмбрионов, так и во второй серии экспериментов при инкубации матерей 10% в РСРА и 55% в цистамине (Рис. 1Б). Кроме того, при инкубации матерей в РСРА и цистамине процент вылупившихся особей значительно ниже в сравнении с процентом вылуплений при инкубации самих эмбрионов.

При инкубации эмбрионов в НТР и в контроле наблюдаются самые быстрые темпы эмбрионального развития, как в первой, так и во второй серии экспериментов. Так при инкубации эмбрионов в НТР вылупление особей происходит через 6,56 дней с момента откладки, тогда как в кон-тороле через 6,87 дней с момента откладки (Рис. 1В). При инкубации матерей в НТР вылупление особей происходит через 6,61

день с момента откладки, тогда как в контроле через 6,83 дней развития (Рис. 1Г). При инкубации в РСРА и Цистамине наблюдаются более продолжительные темпы развития, как в первой, так и во второй серии экспериментов.

Рис. 1. Анализ вылупляемости (% вылупившихся особей и день вылупления). А- процент вылупившихся ювенилей в контроле, а также при инкубации в НТР 10-6 М,РСРА 10-6 М и цистамине 10-6 М. Б- процент вылупившихся ювенилей, полученных от инкубированных матерей в контроле, а также в 10-6 М, РСРА 10-6 М и цистамине 10-6 М. В- продолжительность эмбрионального развития, день вылупления ювенилей в контроле, а также при инкубации в НТР 10-6 М,РСРА 10-6 М и цистамине 10-6 М. Г- продолжительность эмбрионального развития особей, день вылупления ювенилей, полученных от инкубированных матерей в контроле, а также при инкубации в НТР 10-6 М,РСРА 10-6 М и цистамине 10-6 М.

Так, при инкубации в РСРА вылупление происходит через 9,75 дней (Рис. 1В), при инкубации в цистамине вылупление происходит через 7,44 дней развития (Рис. 1В). При предварительной инкубации матерей в РСРА вылупление ювени-лей происходит через 9,72 дня, тогда как при инкубации матерей в цистамине вылупление ювенилей происходит через 7,44 дней (Рис. 1Г).

Обсуждение

В настоящей работе показано, что повышенный уровень серотонина способствует увеличению процента вылупив- шихся особей, а также ускорению темпов эмбрионального развития D. gyrociliatus. Данные результаты согласуются с раннее полученными для этого вида [2].

У беспозвоночных животных функции серотонина достаточно сходны. Так, у большинства изученных трохофорных животных серотонин участвует в контроле локомоции, респираторного поведения, пищеварения и выделения [1, 14, 19]. Также он является основным регулятором локомоторной активности у личинок и взрослых животных, использующих реснички [14, 19]. Серотонинергические нейроны первыми появляются в развитии полихет и ряда моллюсков [17, 18].

Аннелиды D. gyrociliatus обладают коротким жизненным циклом, легко содержатся в лаборатории. Для D. gyrociliatus есть подробные данные о строении нервной системы ювенильных и взрослых особей [2, 3, 5, 8, 21]. В составе нервной системы выделяются крупные, идентифицируемые нейроны [3, 5, 8].

Данные об эффекте серотонина на ресничную локомоцию ювенильных и взрослых особей были получены [2]. До недавнего времени было показано, что серото- нин и его биохимический предшественник 5-НТР ускоряют ресничную локомоцию ювенильных особей и не оказывают влияния на ресничную локомоцию взрослых особей.

Таким образом, полученные результаты дополняют уже существующие. Исследование механизма воздействия серотонина на клетки D. gyrociliatus , а также влияние на продолжительность онтогенеза представляются перспективными и требующими внимания.

Заключение. Повышенный уровень серотонина способствует повышению выживаемости эмбрионов и слегка ускоряет темпы развития, как при аппликации в среде, так и в случае матерей с повышенным уровнем серотонина. Парахлорфенил-аланин при аппликации в среде, так и в организме матери способствует понижению процента вылупившихся особей, а также увеличению темпов эмбрионального развития. Цистамин при аппликации в среде, так и в организме матери способствует понижению процента вылупившихся особей, а также увеличению темпов эмбрионального развития.