Роль температурного фактора в морфогенезе генеративных органов лиственницы сибирской (Larix sibirica)

Автор: Иванова А.Н., Голованова Т.И., Новоселова Н.В.

Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau

Статья в выпуске: 4, 2014 года.

Бесплатный доступ

В ходе исследования выявлено, что на морфогенез генеративных органов лиственницы сибирской оказывают влияние факторы внешней среды: низкие положительные температуры стимулируют воздействие на скорость прохождения материнскими клетками процесса мейоза.

Морфогенез, лиственница сибирская (larix sibirica), низкие положительные температуры, микроспороциты, мейоз

Короткий адрес: https://sciup.org/14083623

IDR: 14083623

Текст научной статьи Роль температурного фактора в морфогенезе генеративных органов лиственницы сибирской (Larix sibirica)

Способность молодых микроспор растений воспроизводить в условиях in vitro целостный организм открывает большие возможности экспериментального получения гаплоидных растений. Гаплоиды являются уникальным и перспективным объектом для клеточной селекции и генетической инженерии растений. Этой проблеме посвящено множество экспериментальных работ и обзорных статей [5, 8, 13, 14].

К настоящему времени накоплен значительный фактический материал по различным аспектам изучения этого явления у представителей различных семейств покрытосеменных растений. Однако не разработана эффективная система массового получения гаплоидов при культивировании мужских генеративных органов, не решены проблемы индукции и регенерации. Остаются неясными механизмы, обусловливающие смену программы развития микроспор с нормального пути созревания на вегетативный путь развития, через эмбриоидо- и каллусогенез в гаплоидное растение. Крайне мало данных по изучению морфогенеза мужских генеративных органов голосеменных.

Ряд исследователей отмечают, что непосредственными причинами морфогенеза являются физиолого-биохимические процессы, происходящие в индивидуальном развитии организма в определенных условиях внешней среды [1– 3, 5– 9, 11, 16, 17].

Одним из важнейших абиотических факторов, определяющих этапность онтогенеза и влияющих на фенотипическое проявление конкретного генотипа растения, являются низкие положительные температуры. Имеются данные о влиянии температурного фактора на становление полярности растительного организма, данный фактор используют как стрессор индукции андроклинии у покрытосеменных растений [8, 14].

Цель работы . Рассмотреть действие низких положительных температур как важный фактор культивирования мужских генеративных органов, при котором происходит высокий выход эмбриоидов.

Объекты и методы. В качестве объектов исследования использовали 30–35-летние деревья лиственницы сибирской, произрастающие на территории экспериментальной базы Института леса «Погорельский бор».

У опытных деревьев Larix sibirica собирали мужские гаметофиты (микростробиллы) с сентября 2003 по май 2004 г. Экспериментальные деревья были разделены на две группы по фенотипическим и морфологическим данным. В первую группу вошли деревья, пораженные лиственничной почковой галлицей, которые отличались от здоровых замедленным ростом и изреженной кроной (рис.1, а). У таких деревьев, как было показано И.Н. Третьяковой [10], идет нарушение мужской сексуализации, то есть превалируют женские шишки. Во вторую группу вошли деревья, не пораженные лиственничной почковой галлицей (рис. 1, б).

а б

Рис. 1. Лиственница сибирская (Larix sibirica Ledeb.): а – не пораженная лиственничной почковой галлицей; б – пораженная лиственничной почковой галлицей

Собранные мужские генеративные органы помещали на модифицированную среду Мурасиге-Скуга [16].

В ходе работы снимали показатели: время прорастания микроспор, размеры пыльцевой трубки; время прохождения мейоза; морфологические особенности материнских клеток микроспор на каждой стадии развития.

Эксперимент проводился в двух вариантах:

1. Часть мужских генеративных органов, собранных с поврежденных и неповрежденных деревьев, помещали в холодильник на трое суток, где температура поддерживалась в пределах + 4 С^о, после чего переносили на среду MS.
2. Другую часть мужских генеративных органов, собранных с поврежденных и неповрежденных деревьев, сразу же помещали на модифицированную среду MS.

Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Схема проведения эксперимента

Результаты и обсуждение. Данные по влиянию температурного фактора на развитие микроспороцитов Larix sibirica in vitro представлены в таблице 1. Необходимо отметить, что для анализа использовали материнские клетки микроспор, которые находились на различных стадиях развития: в осенне-зимний период – на стадии профазы I, в весенний период в микроспороцитах обнаруживалась сильная асинхронность прохождения мейоза (табл. 1), что характерно для хвойных.

Таблица 1

Влияние низких положительных температур на развитие микроспороцитов in vitro , собранных в разные периоды развития микростробил Larix sibirica

Дерево	Месяц	Сутки	Метафаза I	Анафаза I	Телофаза I	Интерфаза	Тетрады	Микроспоры
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Микростробилы, не обработанные низкими положительными температурами +4 С^o
нП	Октябрь	3	11,2	78,2	10,6
		5		0,1	99,9
		7			0,1	10,2	89,7
	Декабрь	3	62,4	37,6
		5	0,7	52,1	47,1	0,1
		7				0,3	21,9	77,8
		14					0,1	99,9
	Апрель	3						100

Окончание табл. 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9
П	Октябрь	3	35,6	64,4
		5		0,7	52,1	47,1	0,1
		7				0,3	21,9	77,8
		14					0,1	99,9
	Декабрь	3	78,2	11,2	10,6
		5		0,1	75,3	24,6
		7					10,3	89,7
		14						100
	Апрель	3						100
Микростробилы, об			работанные низкими положительными температурами +4 С^o
нП	Октябрь	3		9,6	67,3	23,1
		5				89,2	10,8
		7					10,3	89,7
	Декабрь	3		8,4	67,3	24,3
		5					81,3	18,7
		7					19,1	80,9
	Апрель	3						100
П	Октябрь	3		9,1	67,7	23,2
		5				99,9	0,1
		7					2,9	97,1
	Декабрь	3		7,2	92	0,8
		5				0,2	87,7	12,1
		7					14,7	85,3
	Апрель	3						100

В культуре in vitro в октябре месяце у непораженных деревьев большое количество материнских клеток микроспор находилось в анафазе I, а на 7-е сутки культивирования появляются тетрады, на долю которых приходится около 90 %. В декабре, когда лиственница сибирская находилась в состоянии физиологического покоя, распределение микроспороцитов по фазам несколько иное. На 3-и сутки большее количество микроспороцитов находилось на стадии метафазы I, однако на 14-е сутки было обнаружено 100 %-е образование микроспор, покрытых тонкой экзиной. У растений, пораженных лиственничной почковой галлицей, было отмечено в осенне-зимний период неравномерное распределение микроспороцитов по отдельным фазам мейоза, и образование микроспор проходило медленнее (табл. 1).

В весенние сроки культивирования у не пораженных и пораженных деревьев лиственничной почковой галлицей у микроспороцитов происходило быстрое завершение мейоза.

Большой интерес представляют данные по обработке микростробил низкими положительными температурами. В литературе встречаются исследования, где низкие положительные температуры способствовали получению высокого выхода андрогенных культур у пшеницы [5]. В.Ю. Горбуновой впервые обнаружено: «… дифференциальная эксперессия транскриптов, накапливающихся в микроспорах в ответ на воздействие пониженных положительных температур на пыльники яровой мягкой пшеницы поздней стадии микроспорогенеза. Эта спорофитная генетическая информация реализуется в перестройке веретена деления первого митоза и появлении микроспор с двумя равными ядрами, что характеризует начало прямого андрогенеза in vitro » [4].

В наших исследованиях показано, что пониженные положительные температуры оказывали стимулирующее воздействие на прохождение клетками процесса мейоза, микростробилы которых были собраны в осенне-зимний и весенний периоды. Следует отметить, что у микростробил, собранных в данный период, уже на 3-е сутки культивирования микроспороциты находились в анафазе I в отличие от клеток, микростробилы которых не были обработаны низкими положительными температурами.

Несмотря на то, что на 7-е сутки образованы микроспоры как у непораженных, так и у пораженных деревьев, в их размерах были отмечены существенные различия (табл. 2).

Таблица 2

Дерево Месяцп Сутки in vivo 1 Метафаза I1 Анафаза Iп Телофаза Iп Интерфаза Тетрадып Микроспоры
Микростробилы, не обработанные низкими положительными темпе								ратурами +4 С^o
нП	Октябрь	3	37,76 ±0,22	39,17±0,17	56,06 ±0,24	76,01±0,21
		5			54,01±0,21	75,31± 0,18
		7				76,13±0,19	84,21±0,31	91,52 ±0,21
	Декабрь	3	37,92 ±0,20	38,19±0,17	54,6±0,33
		5		38,92±0,24	56,40±0,59	75,68±0,18	85,53±0,16
		7					85,43±0,19	92,01±0,26	101,3±0,15
	Апрель	3	51,27 ±0,16						91,59±0,21
		5							101,08±0,15
		7							115,1±0,31
П	Октябрь	3	34,48 ±0,17	37,76 ± 0,2	41,36±0,21	52,28±0,33
		5			50,21±0,29	60,01±0,36	75,61±0,23	89,75±0,27
		7					76,12±0,12	90,20±0,31	99,89±0,21
	Декабрь	3	35,76 ±0,19	38,4±0,19	39,63±0,25	60,3±0,59
		5			54,7±0,27	73,47±0,18	76,09±0,18
		7						90,56±0,26	91,60±0,38
	Апрель	3	49,92 ±0,12						89,79±0,23
		5							98,09±0,38
		7							102,12±0,26
Микростробилы, обработанные низкими положительными температурами +4 С^o
нП	Октябрь	3	37,76 ±0,22		69,82±0,23	85,46±0,36	90,06±0,28
		5					91,87±0,21	95,3 ± 0,12
		7						96,89±0,27	110,63±0,27
	Декабрь	3	37,92 ±0,20		65,78±0,34	78,26±0,18	89,61±0,18
		5						95,41±0,21	109,56±0,31
		7						19,1	120,31±0,15
	Апрель	3	51,27 ±0,16						93,76±0,28
		5							101,31±0,21
		7							124,3±0,15
П	Октябрь	3	34,48 ±0,17		50,43±0,19	74,89±0,29	80,91±0,21
		5				76,5±0,31	82,84±0,20	89,03±0,25
		7						90,95±0,21	100,8±0,33
	Декабрь	3	35,76 ±0,19		60,11±0,33	77,23±0,59	80,59±0,25
		5					80,65±0,21	85,36±0.23	100,15±0,24
		7						85,95±0,29	100,23±0,38
	Апрель	3	49,92 ±0,12						90,12±0,33
		5							99,89±0,59
		7							106,39±0,38

Размеры микроспороцитов и микроспор

Размеры микроспороцитов, образованных от микростробил не обработанных низкими положительными температурами деревьев, не пораженных лиственничной почковой галлицей, в метафазе I на 3-е сутки отличались от размеров микроспороцитов пораженных деревьев. Существенную разницу наблюдали у непораженных и пораженных деревьев на 5-е и 7-е сутки культивирования. Особенно значительные отличия проявились в анафазе I и телофазе I (табл. 2). Образованные микроспоры имели тонкую экзину и к 14-м суткам культивирования образовывали двухклеточное пыльцевое зерно, которое прорастало с образованием пыльцевой трубки.

Наиболее существенную разницу в размерах микроспороцитов наблюдали у деревьев, обработанных низкими положительными температурами: в осенне-зимний и весенний периоды на 3-е сутки культивирования их размеры составили: у деревьев, не пораженных лиственничной почковой, – 69,82 мкм, а у пораженных – 60,11 мкм. Такая же закономерность наблюдается и на 5- и на 7-е сутки культивирования. У микроспор, полученных таким путем, наблюдаются тонкая экзина и деполяризация клетки.

Таким образом, низкие положительные температуры оказывают положительное влияние не только на прохождение мейоза, но и на размер образованных микроспор.

У микроспор, образованных в осенне-зимний период, наблюдается образование одноклеточного пыльцевого зерна, которое образует пыльцевую трубку на 14-е сутки культивирования (рис. 3, а), а в дальнейшем – ценоцит (рис. 3, б).

Рис. 3. Образование пыльцевой трубки на 14-е сутки культивирования и на 21-е сутки ценоцита

У микроспор, полученных в апреле месяце, на 14-е сутки от момента инокуляции микроспорофиллов на среду in vitro в образованных микроспорах отмечены равные митотические деления с образованием сначала двух равных ядер, а затем двух равных клеток (рис. 4).

Рис. 4. Митотическое деление микроспоры in vitro

Следовательно, низкие положительные температуры оказывают положительное влияние не только на прохождение мейоза, но и на переход от гаметофитного пути на спорофитный. Это объясняется тем, что в результате действия температур подавляется процесс гаметофитной программы развития и запускается тем самым спорофитная программа.

Статья научная