Роль в патогенезе и лечебно-профилактическая значимость токсинов Clostridium difficile



Фиалкина С. В., Белый Ю. Ф.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва

РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ И ЛЕЧЕБНО^ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ТОКСИНОВ

CLOSTRIDIUM DIFFICILE

Введение. Clostridium difficile — грамполо-жительный микроорганизм и частый возбудитель колитов,связанных с применением антибиотиков широкого спектра действия у людей.Развивающийся дисбаланс представителей нормальной флоры толстой кишки способствует размножению патогена и сопровождается продукцией им белковых токсинов — одноцепочечных мультидоменных токсинов TcdA и TcdB и бинарного токсина CDT. После проникновения TcdA, TcdB и CDT в эукариотические клетки путем рецептор-опосредо-ванного эндоцитоза, ферментативные домены TcdA и TcdB модифицируют регуляторные низкомолекулярные ГТФазы семейств Rho/ Ras путем моноглюкозилирования, тогда как А-субъединица токсина CDT АДФ-рибозилирует молекулы мономерного актина. Модификация белков-мишеней приводит к их инактивации и развитию широкого спектра клеточных нарушений с признаками воспалительного поражения слизистой оболочки толстой кишки. Использование токсинов C. difficile в инструментарии научного поиска позволяет получать фундаментальные данные о механизмах физиологических и патологических процессов в эукариотических клетках. С другой стороны, в силу особо важной роли токсинов в патогенезе диффициле-инфекции, данные факторы патогенности рассматриваются в мировой медицинской литературе в качестве основных компонентов разрабатываемых лечебно-профилактических препаратов.В нашей лаборатории проводятся исследования по созданию подобных лечебно-профилактических препаратов на основе нетоксичных производных TcdA и TcdB, специфических однодоменных антител к ним животного происхождения, а также противовоспалительных цитокинов. При этом фрагменты токсинов А и В необходимы для стимуляции антитоксического иммунитета с выработкой организмом собственных нейтрализующих антител к данным белкам (активный иммунитет), однодоменные антитела, экзогенно поступающие в просвет кишечника, способны ингибировать токсическое действие клостридий на клетки эпителия (пассивный иммунитет), а противовоспалительные цитокины необходимы для снижения общей воспалительной реакции тканей кишечника, являющейся важнейшим звеном патогенеза заболевания.

Цель. Разработка комплексного подхода для профилактики и иммунотерапии диффи- циле-колитов с использованием панели генно-модифицированных пробиотических микроорганизмов.

Материалы и методы. С применением молекулярно-генетических методов созданы генетические конструкции, кодирующие токсоиды TcdA и TcdВ, однодоменные антитела к ним, а также модельные белки (зеленый флуоресцирующий белок GFP и люцифераза), содержащие сигнальные пептиды для специфической локализации продуктов (внутриклеточная, мембранная, внеклеточная) и под контролем конститутивных и индуцибельных промоторов. Штаммы безвредных для человека микроорганизмов Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus lactis, Lactobacillus ramnosus, L. plantarum, Bacillus subtilis и B. megaterium (GRAS, “generally regarded as safe”) были трансформированы нуклеотидными последовательностями, кодирующими перечисленные белки.Продукция белков исследовалась в опытах in vitro с использованием флуоресцентной микроскопии, Вестерн-блот-тинга и измерения уровня хемилюминесценции.

Результаты. Проведенные эксперименты показали существенный уровень выработки фрагментов токсинов и антител к ним полученными штаммами-продуцентами in vitro . В зависимости от типа сигнального пептида, исследуемые белки накапливались в цитоплаз-ме,локализовались на поверхности клетки или секретировались во внеклеточную среду.

Выводы. Использование непатогенных штаммов микроорганизмов в качестве векто-ров,способных доставлять в просвет толстой кишки иммунотерапевтические препараты и протективные антигены, является реальным и перспективным подходом для разработки новых препаратов на основе токсоидов C. difficile для лечения диффициле-колитов. Подобный подход может быть использован для терапии и иных заболеваний,связанных с развитием воспалительных процессов кишечника.