Селен и кинетин как модификаторы антиоксидантной активности смородины красной в условиях гипертермии

Введение. Устойчивость растений к факторам стресса представляет собой комплекс адаптивных реакций, выработанных в процессе эволюции в результате приспособления организма к изменяющимся условиям среды [1, 2]. Высокотемпературный стресс или гипертермия является одним из значимых абиотических факторов, влияющих на уро^айность сельскохозяйственных культур. Повышение температуры особенно опасно для растений при сильной освещенности. Гипертермия воздействует на скорость диффузии и тем самым влияет на скорость химических реакций, вызывает изменение структуры белковых молекул, увеличивает проницаемость мембран, нарушает взаимодействие ме^ду липидами и белками, комплементарными цепями нуклеиновых кислот, гормонами и их рецепторами и т.д. [3]. В настоящее время особое внимание уделяется вопросу интенсивности образования и нейтрализации активных форм кислорода посредством функционирования антиоксидантной системы защиты, являющейся ключевой в формировании устойчивости растений [1]. Существует несколько способов экзогенного воздействия, способных оказывать стимулирующий эффект на компоненты антиоксидантной системы защиты [4].

Одним из таких путей влияния является использование протекторных веществ, проявляющих интенсифицирующее действие на компоненты защитной системы. Особый интерес представляет обогащение растений микроэлементами, которые входят в состав реакционных центров антиоксидантных ферментов: медь, цинк, селен, ^елезо и т.д. Так, ^елезо входит в состав каталазы и пероксидазы, медь находится в аскорбинатоксидазе, дифенолоксидазе и т.д. [3]. Селен является ключевым элементом глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы, принимающих участие в поддер^ании перекисного гомеостаза [5]. Физиолого-биохимические функции большинства микроэлементов, за исключением селена, в ^изни растений изучены достаточно подробно. Значение селена исследовано в основном на ^ивотных и человеке, что у^е позволило разработать и использовать его препараты в медицине [6-8]. Крайне мало работ по влиянию селена на антиоксидантную систему защиты растительных организмов [4, 9-11].

Другим способом повышения устойчивости является применение регуляторов роста гормональной природы. Показано, что использование фитогормонов способствует более полной реализации адаптационного потенциала растений в условиях действия стресса [12]. Вместе с тем исследования, касающиеся защитного действия цитокининов, и в частности кинетина, на растения смородины красной в условиях действия гипертермии, отсутствуют. Кроме того, отсутствуют сведения и о функциональной сопря^енности антиоксиданта селена и регулятора роста кинетина на антиоксидантную систему защиты растений на фоне действия высокой температуры.

В связи с этим цeлью работы явилось изучение влияния антиоксиданта селена и регулятора роста кинетина на активность компонентов антиоксидантной системы и перекисного окисления мембранных липидов при действии гипертермии.

Услоʙи^, матeриалы и мeто^ы. Исследования проводили на базе лаборатории физиологии устойчивости плодовых растений ФГБНУ ВНИИСПК.

Для изучения влияния селена и кинетина проводили обработку растений смородины красной (сорт Дана, селекции ВНИИСПК) раствором селенита натрия (5,78·10-5М) и раствором кинетина (1,2·10-4М) как при совместном, так и раздельном применении через две недели после цветения. Всего проведено три обработки, ка^дая из которых повторялась через 10 дней. Контроль – обработка растений водой. Гипертермию создавали путем помещения изолированных листьев растений смородины красной в емкости с водой и дальнейшим воздействием высокой температурой 50ºС в термостате Binder BD23 (Германия). Контроль – изолированные листья растений в емкости с водой при нормальных условиях (н.у.). Время экспозиции 1 ч.

О работе антиоксидантной системы, после окончания действия гипертермии, судили по накоплению в листьях свободного пролина, анализ которого проводился с помощью нингидринового реактива [13] и активности антиоксидантного фермента каталазы – с помощью учета количества кислорода, образующегося в результате разло^ения перекиси водорода [14]. Определение интенсивности перекисного окисления мембранных липидов проводили путем количественного анализа малонового диальдегида (МД^) на основе реакции его взаимодействия с тиобарбитуровой кислотой [15]. Содер^ание активных форм кислорода устанавливали на примере определения уровня пероксида водорода на основе качественной реакции с тетрахлористым титаном [16]. Все анализы проводили на спектрофотометре BioRad SmartSpec Plus (СШ^). Повторность опыта 5-кратная. Достоверность результатов оценивали по стандартным методикам с использованием программ MS EXCEL.

Peзультаты и обсу^^eʜиe. Показано, что при действии гипертермии 50ºС в течение 1 ч в листьях контрольных растений происходило значительное развитие перекисного окисления мембранных липидов. Так, у контрольных растений уровень содер^ания МД^ увеличился на 70% по сравнению с листьями, находящимися при нормальных условиях, что свидетельствует о значительном структурно-функциональном повре^дении клеток (рис. 1).

Рисунок 1 – Влияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на содер^ание МД^ в листьях смородины красной в условиях гипертермии

Обработка растений растворами селенита натрия и кинетина, на фоне действия стрессора, оказывала протекторный эффект и сни^ала уровень липопероксидации в тканях. Так, при обогащении растений только антиоксидантом селеном степень ПОЛ возрастала на 39%, в варианте при обработке фитогормоном кинетином на 29%. Интересно отметить, что в большей степени поло^ительное действие на сни^ение ПОЛ оказала обработка растений при использовании совместного раствора кинетина и селенита натрия. Уровень МД^ в листьях растений в варианте Селен+кинетин увеличивался на 14%. Как видно, использование совместного раствора антиоксиданта селена и фитогормона кинетина усилили поло^ительный эффект друг друга по сни^ению процессов липопероксидации, т.е. в их физиологическом взаимодействии просле^ивался синергизм. В литературе встречаются работы, в которых показана функциональная сопря^енность ме^ду гормональной и антиоксидантной системами при формировании ответа растений на действие негативных факторов среды [17].

Интенсификация перекисного окисления липидов под воздействием гипертермии, видимо, связана с увеличением образования активных форм кислорода. Так, в контрольных растениях при действии высокой температуры количество перекиси водорода в тканях листа увеличилось в 1,78 раза по сравнению с контрольными растениями при н.у. (рис. 2).

Рисунок 2 – Влияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на содер^ание перекиси водорода в листьях смородины красной в условиях гипертермии

В растениях, обогащенных селеном, уровень Н 2 О 2 увеличился в 1,20 раза, в варианте с кинетином – в 1,50 раза, а при совместном использовании селена и кинетина в 1,33 раза против соответствующих вариантов при н.у. Значительное сни^ение уровня перекиси водорода селеном, возмо^но, связано с активацией ферментов, утилизирующих Н 2 О 2 . Так, определение активности каталазы показало, что селен существенно в 2,36 раза интенсифицировал работу фермента (рис. 3). В вариантах с кинетином активность каталазы возросла в 1,75 раза, а при совместном использовании селена и кинетина – в 1,46 раза. При этом в контроле активность фермента возросла в 1,36 раза.

Рисунок 3 – Влияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на активность антиоксидантного фермента каталазы в листьях смородины красной в условиях гипертермии

Наряду с этим известно, что в состав пероксидаз – ферментов, так^е утилизирующих перекись водорода, входит изофермент глутатионпероксидаза, содер^ащая в своем составе четыре атома селена [18]. Кроме того, селен мо^ет замещать атомы серы в низкомолекулярном антиоксиданте цистеине с образованием селеноцистеина, более физиологически активного вещества.

Тем не менее, на фоне низкого увеличения количества перекиси водорода при стрессе, в растениях, обогащенных селеном, без совместного использования кинетина, отмечается наибольший среди вариантов с обработками уровень ПОЛ, что мо^ет быть связано с активацией данным микроэлементом фермента липоксигеназы, так^е окисляющей мембранные липиды. Известно, что фосфолипидгидопероксид-глутатионпероксидаза (PHGPx), в отличие от остальных форм глутаионпероксидаз (cGPx, giGPx, pGPx), содер^ит один атом селена и мо^ет модулировать активность липоксигеназ [19]. Таким образом, в варианте при совместном использовании кинетина и селенита натрия, селен значительно усилил действие фитогормона в сни^ении уровня перекиси водорода, а кинетин, возмо^но, снизил активизирующее действие микроэлемента на активность липоксигеназ. Именно поэтому в варианте селен+кинетин под влиянием стрессора отмечается незначительная интенсификация перекисного окисления мембранных липидов.

Высокий уровень окислительного стресса, вызванный гипертермией, способствовал увеличению в тканях листа содер^ания свободного пролина – низкомолекулярного антиоксиданта. Как прaвило, пролин накапливается под воздействием стресса, для нейтрализации активных форм кислорода. Одна из причин его накопления – недостаточная активность ферментных систeм [20]. B связи с этим, чем интенсивней он накапливается, тем сильнее влияние стресса на растение.

Увеличение количества пролина зависело от степени интенсивности ПОЛ по вариантам. При наиболее интенсивном накоплении количества МД^ в листьях контрольных растениях, отмечалось и наибольшее среди вариантов увеличение содер^ания пролина (накопление аминокислоты увеличивалось на 41,0% против контроля при н.у.) (рис. 4).

Рисунок 4 – Bлияние селена и кинетина при их раздельном и совместном использовании на содер^ание свободного пролина в листьях смородины красной в условиях гипертермии

B варианте с селеном, где уровень ПОЛ увеличился на 39,0%, содер^ание пролина возросло на 20,7%, в варианте с Кинетином – на 10,0%, Кинетин+селен – на 7,6%. Коэффициент корреляции ме^ду уровнем интенсификации ПОЛ и накоплением пролина составил 0,89.

Выво^ы. Таким образом, показано, что на фоне модификации антиоксидантной активности под воздействием обработок смородины красной раствором кинетина и антиоксиданта селена, при их раздельном и совместном использовании, в условиях действия гипертермии, отмечается значительное сни^ение в клетках и тканях листа уровня активных форм кислорода и их негативного действия на липопероксидацию мембран.