Синтез и характеристики карбоксиметилированных производных хитина из панцирей камчатского краба и краба-стригуна

DOI:

e-mail: , ORCID:

Новиков В. Ю. и др. Синтез и характеристики карбоксиметилированных производных хитина из панцирей камчатского краба и краба-стригуна. Вестник МГТУ. 2026. Т. 29, № 3. С. 347–360. DOI:

e-mail: , ORCID:

Novikov, V. Yu. et al. 2026. Synthesis and characteristics of carboxymethylated chitin derivatives from the shells of king crab and snow crab. Vestnik of MSTU, 29(3), pp. 347–360. (In Russ.) DOI:

Природные полисахариды представляют собой высокомолекулярные соединения, построенные из элементарных звеньев моносахаридов, соединенных между собой гликозидными связями ( Mohammed et al., 2021; Zhang et al., 2022 ). Значительный интерес к полимерам природного происхождения – хитину и хитозану – объясняется уникальным комплексом физико-химических свойств этих полисахаридов и широким спектром их биологической активности ( Wang et al., 2020 ). Хитин и его водорастворимые производные широко используются в медицине и фармацевтике, пищевой промышленности, сельском хозяйстве, природоохранных технологиях, парфюмерно-косметической промышленности, биотехнологиях и других областях ( Younes et al., 2015; Patel et al., 2026 ). В России источником хитинсодержащего сырья являются промысловые крабы на Дальнем Востоке, северная креветка и акклиматизированный в Баренцевом море камчатский краб. Основным промышленным методом получения хитина и хитозана является химический способ переработки панциря ракообразных ( Новиков и др. 2018; Santos et al., 2020 ).

Химический гидролиз хитина и хитозана как кислотный, так и щелочной, заключается в расщеплении ацетамидных и гликозидных связей, что приводит к процессам деацетилирования, связанным с расщеплением ацетамидных связей, и деструкции, выраженной расщеплением гликозидных связей ( Хитин и хитозан…, 2002; Novikov et al., 2023 ). Процесс получения хитозана из хитинсодержащего сырья состоит из двух этапов: выделение хитина и его последующее щелочное деацетилирование. Значительным преимуществом хитозана является его растворимость в воде (в кислых водных средах) в отличие от хитина ( Schröder et al., 2025 ). Растворимость хитозана растет с увеличением его степени деацетилирования.

Химическая модификация природных полисахаридов хитина и хитозана с получением водорастворимых соединений расширяет области их практического использования. Особое место среди водорастворимых производных хитина и хитозана занимают его карбоксиметилированные производные ( Пестов и др., 2007; Mourya et al., 2010; Боймирзаев, 2024 ). Карбоксиметилированные производные сохраняют все уникальные свойства хитина и хитозана, например, такие как биосовместимость и биоразлагаемость, антимикробная активность, пленкообразующая способность и способность к гелеобразованию, хелатирующая способность и др. При этом они обладают рядом преимуществ, а именно: высокой растворимостью в воде (включая нейтральные и щелочные водные среды), амфотерными свойствами, способностью проявлять полиэлектролитные свойства в водных растворах ( Islam et al., 2023 ).

Цель работы – получение хорошо растворимых в воде карбоксиметилированных производных хитина (карбоксиметилхитина) из хитозана, выделенного из хитинсодержащего сырья Баренцева моря – панцирей камчатского краба и краба-стригуна опилио. Особое внимание уделено изучению растворимости и структурных свойств карбоксиметилированных производных хитина.

Материалы и методы

Сырьем для получения карбоксиметилированных производных служил хитозан, полученный из панциря камчатского краба ( Paralithodes camtschaticus ) и краба-стригуна опилио ( Chionoecetes opilio ) с использованием известной технологии ( Новиков и др., 2012 ). Степень деацетилирования хитозана 72–83 %, средняя молекулярная масса 124 кДа.

Карбоксиметилхитин получали в две стадии. На первой стадии мы проводили ацетилирование хитозана (получение хитина) под действием ангидрида уксусной кислоты, варьируя концентрацию уксусного ангидрида в диапазоне от 10 до 30 % и время взаимодействия – от 1 до 24 часов. Схема реакции ацетилирования приведена на рис. 1, а . На второй стадии мы карбоксиметилировали ацетилированный хитозан (хитин) действием монохлоруксусной кислоты в щелочной среде. Время взаимодействия варьировали в диапазоне от 3 до 7 суток. Схема реакции приведена на рис. 1, б .

Степень деацетилирования определяли методом ИК-спектроскопии с использованием ИК-спектрометра Shimadzu IRTracer-100 (Япония) в диапазоне частот от 2 000 до 700 см ^{- 1}. Определение содержания карбоксиметильных групп в карбоксиметилхитине (в % от массы образца) проводили методом кондуктометрического титрования ( Новиков и др., 2012 ) с использованием кондуктометра АНИОН 4100 (Россия). Молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение определяли методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), определения проводили на хроматографе LC-10A_VP Shimadzu (Япония). Выходящие с колонок хроматографа фракции регистрировали по оптическому поглощению продуктов гидролиза с использованием диодной матрицы SPD-M10A VP и ультрафиолетового спектрофотометрического детектора SPD-10A_VP при длине волны 205 и 210 нм. Для математической обработки данных использовали программу MаgicPlot 3.0.1 (Magicplot Systems, LLC, Россия).

Растворимость синтезированного карбоксиметилхитина определяли при разных рН, вычисляя разность между массой взятого на анализ полимера и массой нерастворимого остатка. Рентгенофазовый анализ исследуемых образцов полимера был выполнен на дифрактометре Shimadzu LabX XRD-6000 (Япония). Эксперимент проводили с использованием рентгеновской трубки Cu-Кα, графитового монохроматора с длиной волны монохроматического рентгеновского излучения λ = 1,54178 Å. Степень кристалличности определяли по методике, приведенной в работе (Новиков и др., 2012).

(СН 3 СО) 2 О

а

б

R = CH2COONa

R = CH;,COONa

Рис. 1. Схемы реакций: а – ацетилирование хитозана с получением хитина; б – карбоксиметилирование хитина с получением карбоксиметилхитина Fig. 1. Reaction schemes: a – acetylation of chitosan to produce chitin;

б – carboxymethylation of chitin to produce carboxymethyl chitin

ClCH 2 COOH

NaOH

Соляная кислота (37 %), гидроксид натрия (98 %), ангидрид уксусной кислоты, уксусная кислота (99,7 %), ацетон (99,5 %), этанол (99,8 %), изопропанол (99,5 %) и монохлоруксусная кислота (≥99 %) были закуплены у компании Merck (Германия). Используемые реагенты были аналитического класса и использовались без дополнительной очистки.

Результаты и обсуждение

При получении карбоксиметилхитина мы преследовали в первую очередь следующую цель – получение водорастворимого производного хитина, пригодного для определения молекулярной массы полимера методом жидкостной хроматографии. Макромолекулы хитина и хитозана могут иметь разную степень деацетилирования, что сказывается на молекулярной массе полисахарида даже при одинаковой степени полимеризации. Поэтому в работе было проведено ацетилирование хитозана с целью приведения молекулярной массы мономерного звена биополимера к одному значению. В результате подобной операции из полисахаридов (сополимеров D-глюкозамина и N-ацетилглюкозамина) с разной степенью деацетилирования получается полимер хитин (N-ацетилглюкозамин), отличающийся только степенью полимеризации. Затем мы получали из полностью ацетилированного хитина карбоксиметилхитин, характеризующийся высокой растворимостью в водных средах. Такой линейный полимер можно использовать для определения его молекулярной массы, например, методом эксклюзионной жидкостной хроматографии.

В данной работе были определены условия процесса ацетилирования хитозана для достижения минимальной степени деацетилирования. На рис. 2 в качестве примера представлены ИК-спектры ацетилированных образцов, полученных при разном времени протекания реакции ацетилирования и концентрации ангидрида уксусной кислоты, равной 20 %. ИК-спектры были смещены относительно друг друга для наилучшего восприятия рисунка.

Результаты экспериментов показали, что полностью ацетилированных образцов хитина со степенью деацетилирования, приближающейся к 0 %, получить не удалось. Степень деацетилирования образцов варьируется в диапазоне 11,6–18,0 %, что несколько меньше, чем для природного хитина. Показано, что степень деацетилирования полученных образцов хитина не зависит от концентрации ацетилирующего агента (ангидрида уксусной кислоты). Варьирование времени реакции в интервале от 10 до 120 мин показало, что основное уменьшение степени деацетилирования происходит в первые 15 мин реакции. На основании проведенных экспериментов были выбраны условия проведения ацетилирования хитозана, а именно: концентрация уксусного ангидрида 20 % и время ацетилирования 15 мин. При этом степень деацетилирования хитозана, полученного из панциря камчатского краба, варьируется в диапазоне от 12 до 16 %, а хитозана из панциря краба-стригуна составляет от 3 до 10 %.

v , см^–1

Рис. 2. ИК-спектры ацетилированных образцов хитозана. Время (мин) реакции ацетилирования указано на графике; концентрация ангидрида уксусной кислоты 20 %; исходная степень деацетилирования хитозана 83 %, использован хитозан из панциря камчатского краба Fig. 2. IR spectra of acetylated chitosan samples. The acetylation reaction time (min) is indicated on the graph; acetic anhydride concentration is 20 %; the initial degree of deacetylation of chitosan is 83 %, chitosan from the shell of the king crab is used

Недостижимость снижения степени деацетилирования до нуля, по-видимому, связана со структурными особенностями хитозана. Известно, что хитозан имеет высокоупорядоченную структуру, образованную макромолекулами в конформации спирали. Жесткость и стабильность структуры хитозана поддерживается водородными связями гидроксильных аминогрупп, атомом кислорода пиранозного кольца и гликозидными связями ( Wang et al., 2020 ). Возможно, в силу таких конформационных особенностей некоторые группы хитозана закрыты для реакции ацетилирования.

Далее были определены условия процесса карбоксиметилирования хитина (ацетилированного хитозана) (рис. 1, б ) при варьировании времени протекания реакции ( Кличева и др., 2016 ). Показано, что содержание карбоксиметильных групп в полимере зависит от времени карбоксиметилирования (рис. 3). Наиболее подходящее время продолжительности процесса – 7 суток, в течение которого содержание карбоксиметильных групп достигает 38 %.

Образцы карбоксиметилхитина, полученные в условиях карбоксиметилирования хитина в течение 7 суток, обладали высокой растворимостью в водных средах, которая тем не менее зависит от рН среды, что хорошо согласуется с опубликованными в литературе данными ( Chen et al., 2004; Gao et аl., 2019 ). Растворимость карбоксиметилхитина увеличивается при переходе из кислой среды в щелочную (табл. 1).

При рН 8 она составляет около 82 %, что обусловлено полной ионизацией карбоксильных групп ( Muzzаrelli et al., 1982; Chen et al., 2003а ) и усилением гидратации макромолекул.

а

τ , сутки б

Рис. 3: а – кривые кондуктометрического титрования для образцов хитина, время карбоксиметилирования указано на графике; б – зависимость содержания карбоксиметильных групп (КМГ) от времени карбоксиметилирования. Использован ацетилированный хитозан (хитин) из панциря камчатского краба

Fig. 3: a – conductometric titration curves for chitin samples, the time of carboxymethylation is indicated on the graph; б – dependence of the content of carboxymethyl groups (CMG) on the time of carboxymethylation. Acetylated chitosan (chitin) from the shell of the king crab is used

Таблица 1. Растворимость карбоксиметилхитина, полученного в условиях карбоксиметилирования хитина в течение 7 суток, при разных значениях рН

Table 1. Solubility of carboxymethyl chitin obtained under conditions of carboxymethylation of chitin for 7 days at different pH values

рН	5,0	7,0	8,0
Растворимость, %	75,5 ± 0,2	80,0 ± 0,2	81,5 ± 0,3

Все дальнейшие эксперименты были проведены с карбоксиметилхитином, полученным путем реакции карбоксиметилирования в течение 7 суток.

Одной из важнейших характеристик биополимера является молекулярно-массовое распределение, во многом определяющее его функциональные свойства. В нашей работе для определения молекулярномассового распределения карбоксиметилхитина был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. На рис. 4, а представлена хроматограмма синтезированного образца карбоксиметилхитина.

Основной пик, наблюдаемый на хроматограмме , соответствует карбоксиметилированным фрагментам биополимера.

Для анализа сложного хроматографического профиля, представленного на рис. 4, а , была применена математическая обработка данных в программе MаgicPlot 3.0.1. Исходный сигнал подвергался разложению на гауссианы (рис. 4, б , кривые 1–7), форма полосы определялась с помощью функции Гаусса, которая описывается уравнением

2,77( E - z )2 y (E ) = A ■ e    w2   , где А – амплитуда пика, z – положение максимума, w – полуширина на полувысоте.

V , мл

Рис. 4: а – хроматограмма карбоксиметилхитина; б – пример разложения на гауссианы спектра карбоксиметилхитина. Хитин получен из панциря краба-стригуна

Fig. 4: a – chromatogram of carboxymethyl chitin; б – example of decomposition into Gaussians of the spectrum of carboxymethyl chitin. Chitin is obtained from the shell of the opilio snow crab

Полученные компоненты соответствуют различным химическим формам карбоксиметилхитина, включая монокарбоксиметилированные фрагменты, дикарбоксиметилированные производные, а также возможные примеси. Суммарная кривая Fit Sum, представляющая собой суперпозицию всех гауссовых компонент, практически полностью воспроизводит исходный хроматографический профиль, что дополнительно подтверждает корректность проведенного анализа.

Современные исследования в области анализа модифицированных полисахаридов подтверждают, в частности, что комбинация ВЭЖХ с методами математического моделирования позволяет не только точно определять степень замещения, но и выявлять тонкие структурные особенности модифицированных полимеров ( Chen et al., 2003б; Радевич и др., 2014 ). Такой комплексный подход обеспечивает получение репрезентативных данных о молекулярно-массовых характеристиках и гетерогенности образцов.

Полученные данные позволили провести анализ молекулярно-массового распределения карбоксиметилхитина (табл. 2). Исследованный образец демонстрирует выраженную полидисперсность, что характерно для продуктов химической модификации природных полимеров.

Таблица 2. Молекулярно-массовое распределение карбоксиметилхитина Table 2. Molecular mass distribution of carboxymethyl chitin

№ фракции (№ кривой, рис. 4, б )	ММ фракции, kDа	Массовая доля фракции, %
2	656,40 ± 0,70	4,22 ± 0,31
3	255,45 ± 0,50	5,70 ± 0,11
5	120,55 ± 0,52	17,72 ± 0,20
1	34,59 ± 0,61	66,96 ± 0,25
6	14,93 ± 0,49	0,65 ± 0,09
4	0,58 ± 0,09	4,57 ± 0,12
7	0,05 ± 0,03	0,19 ± 0,08
Σ		100,00

Анализ хроматографических данных (табл. 2) выявил наличие семи основных фракций с молекулярными массами, варьирующимися в широком диапазоне от 0,05 до 656,40 kDа. Наибольший вклад в общий состав (66,96 %) вносит фракция с молекулярной массой 34,59 kDа. Особый интерес представляет обнаружение высокомолекулярной фракции (656,40 kDа), содержание которой составляет 4,22 %, что убедительно доказывает образование карбоксиметильных производных с высокой степенью полимеризации и свидетельствует о возможности образования разветвленных структур или ассоциатов макромолекул в процессе карбоксиметилирования.

Одновременно в образце присутствуют и низкомолекулярные компоненты (менее 15 kDа), суммарное содержание которых не превышает 5,4 %, что может быть связано с наличием олигомерных форм или промежуточных продуктов реакции. Например, пик с ММ 0,58 кДа может соответствовать карбоксиметильному эфиру димера хитина. Современные исследования в области химии модифицированных полисахаридов ( Jung et al., 2013 ) подтверждают, что подобное распределение молекулярных масс является типичным для карбоксиметилхитина и отражает особенности процесса его получения.

Обнаруженное преобладание фракции с молекулярной массой около 35 kDа (66,96 %) полностью соответствует литературным данным ( Lei et al., 2022 ), согласно которым основная часть модифицированного полимера обычно имеет молекулярную массу в диапазоне 20–50 kDа.

Полученные результаты имеют важное значение для понимания взаимосвязи между условиями проведения модификации хитина и молекулярно-массовыми характеристиками конечного продукта, что особенно актуально при разработке материалов с заданными свойствами для биомедицинского применения.

Структурные свойства твердого биополимера во многом определяют его функциональные свойства. Определение наличия кристаллических и аморфных областей в структуре хитина и его карбоксиметилированных производных является актуальной задачей, поскольку наличие таких областей часто рассматривается в качестве объяснений кинетических закономерностей реакций, например, деацетилирования хитина ( Kurita et al., 1977 ). В более поздних работах показано, что выяснение влияния структурных особенностей хитина и его производных на кинетику химических реакций требует дополнительных исследований ( Novikov et al., 2023 ).

В нашей работе мы определяли кристалличность хитозана и его карбоксиметильных производных методом рентгенофазового анализа. Полученные дифрактограммы для хитозана, ацетилированного хитозана (хитина) и карбоксиметилхитина (рис. 5) имеют вид, характерный для образцов, содержащих кроме кристаллической и аморфную фазу. Они содержат пики, имеющие в основании широкую линию (галло) с угловой шириной 2ϴ =10–20° ( Вихорева и др., 2001 ).

На рис. 5, а в качестве примера приведена дифрактограмма исходного хитозана со степенью деацетилирования 83 %. На рис. 5, б представлена дифрактограмма ацетилированного образца хитозана со степенью деацетилирования 10,4 %, а на рис. 5, в – дифрактограмма карбоксиметилхитина. Был проведен качественный рентгенофазовый анализ, состоящий из идентификации кристаллических фаз на основе присущих им значений межплоскостных расстояний, d, и соответствующих интенсивностей линий, I, рентгеновского спектра. Результаты обработки дифрактограмм приведены в табл. 3.

Рис. 5. Дифрактограммы: а – исходного хитозана, полученного из панциря камчатского краба, степень деацетилирования 83 %; б – ацетилированного хитозана (хитина); в – карбоксиметилхитина Fig. 5. X-ray diffraction patterns: а – initial chitosan obtained from the shell of the Kamchatka crab, degree of deacetylation 83 %; б – acetylated chitosan (chitin); в – carboxymethyl chitin

Таблица 3. Результаты обработки дифрактограмм образцов исходного хитозана, ацелилированного хитозана и карбоксиметилхитина

Table 3. Results of processing diffraction patterns of samples of original chitosan, acelylated chitosan and carboxymethyl chitin

03 о	Образец	2ϴ 1, град	d 1 (Å)	2ϴ макс.инт, град	I 0 макс.инт.	d макс.инт. (Å)	Степень кристалличности, %
1	Хитозан ММ = 124 кДа, СД = 83 %	9,34	9,46	19,90	94,0	4,46	54
2	Ацетилированный хитозан (получен из образца 1) СД 10,4 %	9,13	9,68	19,34	161,0	4,58	57
3	Карбоксиметилхитин (полученный из образца 2)	9,18	9,63	19,40	165,0	4,57	52

Примечание. ϴ – угол падения рентгеновского луча, d – межплоскостное расстояние, I ₀ – максимальная интенсивность.

На дифрактограммах хитозана, хитина и карбоксиметилхитина (рис. 5, табл. 3) положение пиков с максимальной интенсивностью I0 находится в диапазоне 2ϴ = 19,40–19,90°. Им соответствуют межплоскостные расстояния d = 4,46–4,58 Å. Для межплоскостных расстояний d = 9,46–9,68 Å на дифрактограммах присутствуют пики при 2ϴ = 9,18–9,34°. Для хитозана положение максимального пика наблюдается при 2ϴ = 19,90°, кроме того, при 2ϴ = 9,34° обнаружен пик, которому соответствует межплоскостное расстояние d = 9,46 Å. Полученные результаты согласуются с литературными данными по изучению дифракции крабового хитина и его производных (Focher et al., 1992). У ацетилированного хитозана (хитина) положение пика с максимальной интенсивностью соответствует 2ϴ = 19,34° и межплоскостному расстоянию d = 4,58 Å; также обнаружен пик при 2ϴ = 9,13° для межплоскостного расстояния d = 9,68 Å.

Для карбоксиметилхитина получена дифрактограмма с практически идентичным положением пиков, как у исходного хитина. Для него положение пика с максимальной интенсивностью соответствует 2ϴ = 19,40° в области межплоскостного расстояния d = 4,57 Å, также обнаружен пик в области межплоскостного расстояния d = 9,63 Å при 2ϴ = 9,18°.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что модификация хитозана с помощью реакций ацетилирования и карбоксиметилирования практически не влияет на положение пиков на дифрактограммах (2ϴ находятся в пределах 9,18–9,34 град) и положения межплоскостных расстояний, которым эти пики соответствуют (4,46–4,58 А). Таким образом, степень кристалличности исходного хитозана, ацетилированных и карбоксиметилированных образцов изменяется незначительно в диапазоне 52–57 %.

Заключение

Целью данного исследования была разработка способа получения производного хитина – карбоксиметилхитина и выбор условий синтеза, необходимых для обеспечения хорошей растворимости карбоксиметилированного производного в водных средах. В качестве сырья использован хитозан, полученный из панцирей камчатского краба и краба-стригуна. Установлены необходимые условия ацетилирования хитозана (концентрация уксусного ангидрида 20 %, время реакции 15 мин) и последующего карбоксиметилирования хитина (время реакции 7 суток), позволяющие получить водорастворимые образцы, имеющие близкий химический состав. Содержание карбоксиметильных групп в карбоксиметилхитине составило 38 %, что в 1,7 раза превышает их содержание в полимере при карбоксиметилировании по методикам, описанным в литературе.

Карбоксиметилхитин, полученный по разработанному методу, был проанализирован на растворимость в воде, определено его молекулярно-массовое распределение по данным ВЭЖХ и структурные свойства по данным рентгенофазного анализа. Показано, что растворимость карбоксиметилхитина увеличивается с увеличением рН и составляет около 82 % от массы полимера при рН 8,0. Степень кристалличности исходного хитозана, ацетилированных и карбоксиметилированных образцов отличается незначительно и находится в диапазоне 52 - 57 %. При характеристике молекулярно-массового распределения карбоксиметилхитина из панциря краба-стригуна обнаружено наличие шести основных фракций с молекулярными массами от 0,05 до 656,40 kDa. Наибольший вклад (67 %) вносит фракция с молекулярной массой 35 kDa.

В целом данное исследование вносит ценные сведения в области получения водорастворимых карбоксиметилированных производных хитозана из отходов промышленной переработки ракообразных и подчеркивает важность современных подходов к комплексной переработке морских биоресурсов. Проведенное исследование может быть полезно для предприятий, занимающихся промышленной добычей и переработкой крабов для решения задач безотходного использования сырья и получения при этом востребованных на рынке биотехнологий биополимеров.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект № 25-16-00064.