Система медиаторов иммунной регуляции как маркеров иммунологических нарушений у школьников в условиях повышенного поступления стронция с питьевой водой

Ионы стронция близки к ионам кальция и могут замещать последние в организме, что и является основным типом действия соединений этого элемента [1, 11, 12]. Стронций биологически конкурирует с кальцием. Показано, что ионы стронция, имея иной диаметр, нежели ионы кальция, способны блокировать ионные каналы для последнего, что может определить ингибирующее влияние стронция на иммунную реакцию, отмеченное для естественных киллеров, а также воздействие на другие клетки организма, прежде всего костную систему [7, 9]. Распознавание Т- и В-лимфоцитами небольших молекул, каковыми являются металлы, объясняют гаптенной гипотезой, согласно которой гаптены становятся полными антигенами, ковалентно связываясь с большими протеинами или пептидами. Реакции адаптации проявляются на уровне различных и в первую очередь регуляторных систем, которые в последнее время рассматриваются в качестве функционально единых систем, определяющих поддержание гомеостаза [2, 3]. Одними из основных звеньев иммунитета, осуществляющих иммунный ответ на средовые, в том числе техногенные химические факторы, являются регуляторные и эффекторные системы адаптивной ветви иммунитета. Поэтому для углубленного изучения состояния иммунного ответа на токсиканты в качестве индикаторных диагностических критериев сенсибилизации используют показатели специфического иммунитета – продуцируемые Т- и В-лимфоцитами цитокины и специфические антитела, а также различные гуморальные медиаторы [10, 13, 15]. В ходе развития иммунных реакций происходит высвобождение медиаторов – цитокинов, эндогенных регуляторов и эффекторов иммунной системы [6, 14]. Цитокины являются сигнальными секретируемыми протеинами, которые участвуют в межклеточном и межсистемном взаимодействии, клеточном росте, дифференциации и активации; регулируют цитотоксические (противовирусные и противоопухолевые), гуморальные, клеточно-опосредованные (Th1 или Th17) или аллергические (Th2) иммунные реакции, результат которых определяется балансом продуцируемых цитокинов с про-или противовоспалительными свойствами, также играют роль в процессах регуляции костного метаболизма [4, 5, 8]. Индикация спонтанного и индуцированного уровня медиаторов in vitro позволяет выявить функциональные адаптивные резервы иммунной системы в ус- ловиях экспозиции средовых антигенов, в качестве которых выступают металлы [2].

Цель работы – определить маркерные показатели иммунологических нарушений у школьников в условиях повышенного поступления стронция с питьевой водой.

Материалы и методы. При углубленном изучении состояния здоровья школьников Пермского края выполнено генетическое и иммунологическое диагностическое обследование 113 детей в возрасте от 7 до 9 лет, постоянно проживающих в эндемичной зоне, характеризующейся повышенным содержанием стронция в подземных водах (1,2 ПДК). Группу контроля составили 57 детей, проживающих на территории, характеризующейся нормативным уровнем качества воды по содержанию стронция. Группа наблюдения и контрольная группа были сопоставимы по этническому, гендерному и возрастному составу, соматической заболеваемости и социальному статусу. Выборка обследуемых была достаточна для достоверного определения межгрупповых отличий.

Исследование биосред на содержание металлов (мг/дм3) выполнено методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Cодержание IgG специфических к стронцию определяли методом аллергосорбентного тестирования с ферментной меткой. На нитроцеллюлозной подложке производили конъюгацию тестируемого химического вещества с белком, в качестве контроля использовали 0,5 % раствор хлорида натрия. В дальнейшем производили инкубацию исследуемой сыворотки с антигенными комплексами, сорбированными на нитроцеллюлозной подложке, и связывание Fab-фрагментов специфических антител человека. На втором этапе иммуноферментного анализа для образования классического «сэндвича» в опытный и контрольный образец вносили конъюгированные с пероксидазой хрена моноклональные антитела к Fc-фрагменту IgG человека с последующим конкурентным связыванием специфических антител к химическому веществу со специфическими участками вариабельных доменов Fab-фрагментов моноклональных антител. После промывки лунок фосфатным буфером и проявления окраски посредством добавления хромогенного субстрата останавливали реакцию стоп-реагентом и производили удаление отработанных подложек, осуществляли фотометрическое измерение и регистрацию оптической плотности в опытном и контрольном образцах. Сопоставляли их с оп- тической плотностью стандартных образцов с известной концентрацией иммуноглобулина G к белку куриного яйца. Для получения таких стандартных образцов параллельно изготовляли калибровочные диски, на которые конъюгировались образцы с известным содержанием человеческих антител IgG к белку куриного яйца. Использовали стандартные образцы IgG, конъюгат, хромогенный субстрат и стоп-реагент из набора реагентов для определения общего IgG∗, специфического IgG**.

Анализ маркеров клеточной регуляции IL-6, IL-10, IL-17, системы α-TNF, GM-CSF, VEGF в сыворотке, а также оценка секреции данных цитокинов путем активации мононук-леарных клеток цельной крови ex vivo стронцием исследовали методом ИФА с использованием тест-систем для определения цитокинов и «ЦИТОКИН-СТИМУЛ-БЕСТ» фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) на анализаторе «Elx808IU». Действие комплекса митогенов и стронция (стронций 0,01 мг/мл) на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками крови оценивали с помощью индекса влияния, который рассчитывали как отношение продукции цитокина клетками крови, стимулированных этими активаторами, к уровню спонтанной продукции

Маркеры костного метаболизма RANKL и OPG определяли методом ИФА с использованием тест-систем «ampli-sRANKL» и «Osteo-progerin» фирмы «Biomedica» (Австрия).

Содержание IL-12 вычисляли с помощью иммуноферментных наборов «hIL-12+p40» (BioSource Europe S.A., Бельгия), которые позволяют выполнять определение общего уровня IL-12 путем измерения биоактивного гетеродимера p35-p40 и антагониста гомодимера p40-p40; стандарты в наборе прокалиброваны по Международному стандарту 95/544 для человеческого IL-12 (NIBSC, Herfordshire, UK, EN6 3QG).

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием пакета прикладных программ Statistica (V.6.0). Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики с расчетом средней арифметической и её стандартной ошибки. Достовер- ность различий оценивали с помощью критерия t Стьюдента. Различия считали достоверными при значении p≤0,05. Проводили корреляционный анализ (система парных линейных математических моделей) зависимостей «гаптен – специфический иммунный ответ». При отсутствии нормального распределения выборочных данных, при малом числе наблюдений использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Изучение статистических взаимосвязей проводили путем расчета коэффициентов корреляции Спирмена (rs). Характер статистического распределения по выборкам устанавливали по критерию согласия – χ2. Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных (%) частот, количественные признаки представлены как M±m (среднее арифметическое ± ошибка среднего). Различия между группами считали значимыми при р<0,05. Проверка статистических гипотез выполнялась при критическом уровне p≤0,05.

Результаты и их обсуждение. Анализ качества воды хозяйственно-питьевого водоснабжения детских учреждений на исследуемой территории (г. Кунгур) свидетельствовал о превышении концентрации стронция относительно территории сравнения (п. Сива) в 7 раз (7,49±0,38 и 0,91±0,15 мг/л соответственно).

В крови детей, проживающих в зоне с повышенным содержанием стронция, установлена кратность превышения данного элемента относительно группы сравнения в 3,9 раза (0,125±0,021 и 0,031±0,003 мкг/см³ соответственно; референтный интервал 0,01–0,077 мкг/см³).

Проведенные клинико-лабораторные исследования выявили наличие патологических изменений со стороны иммунной системы школьников на исследуемой территории: установлен повышенный по сравнению с возрастной нормой уровень специфической сенсибилизации к стронцию по критерию IgG (содержание специфического IgG к стронцию – 0,142±0,03 усл. ед.* при норме <0,10), в группе контроля – 0,107±0,014.

По результатам углубленного изучения воздействия стронция на цитокинпродуцирую-щую активность иммунокомпетентных клеток крови детей выявлена разница в динамике стимулированной стронцием продукции медиаторов в условиях предварительной сенсибилизации стронцием и при её отсутствии (табл. 1).

Таблица 1

Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов клетками периферической крови школьников, значение медианы (25–75-й перцентиль), пг/см3 (эксперимент)

Параметр	Группа	Цитокины
		IL-6	IL-10	IL-12	IL-17
Спонтанная продукция	Контроль	637,5 (262,5-957,5)	5,765 (4,075–12,42)	48,84 (43,12–67,95)	2,26 (1,8575–2,62)
	Наблюдение	415 (144–997,5)	4,45 (3,67–7,08)	18,53 (7,89–29,01) *	2,41 (1,33–2,8)
Продукция, индуцированная стронцием	Контроль	101500 (81000–166750)	5,61 (4,1625–8,91)	37,41 (25,0–81,69)	2,47 (2,20–2,55)
	Наблюдение	52500 (39100–86325) *	5 (4,05–11,22)	24,38 (13–45,36)	1,45 (1,18–1,84) *
Индекс влияния
Стронций	Контроль	143,38 (93,58–530,92)	0,90 (0,54–1,51)	1,03 (0,61–1,42)	1,04 (0,89–1,39)
	Наблюдение	201,96 (55,04–423,89)	1,09 (0,79–2,00)	1,29 (0,85–1,77)	0,79 (0,37–1,36) *

П р и м е ч а н и е: * – разница достоверна по сравнению с группой контроля при значении p <0,05.

Анализ индуцируемой продукции провос-палительного IL-6, цитокина, участвующего в процессах костного ремоделирования, показал, что в обследуемой группе индуцированная стронцием продукция IL-6 достоверно ниже уровня контрольной группы. Под влиянием стронция секреция цитокина возрастает в обеих группах. При этом в обследуемой группе школьников кратность значения стимуляции (201) выше, чем у школьников контрольной группы (143). Индекс влияния стронция на синтез IL-6 как раннего медиатора, показывающего выраженную реакцию в условиях активации, превышает данный показатель остальных изучаемых цитокинов.

Не установлено влияние стронция на синтез противовоспалительного IL-10, спонтанные значения не имеют достоверного различия, но в обследуемой группе уровень данного цитокина выше, чем в контрольной, в 1,3 раза.

Спонтанный уровень провоспалительного IL-12, участвующего в дифференцировке Th0 в сторону Thl и осуществляющего клеточную защиту, в обследуемой группе ниже, чем в контрольной ( p <0,05). Индуцированная стронцием продукция в обеих группах не имеет достоверной разницы по сравнению со спонтанной, но более значимые изменения в выработке цитокина обнаруживаются в группе наблюдения: ИВ стронция – 1,29, в контрольной – 1,03.

Не выявляется резервный потенциал IL-17 в группе детей, имеющих предварительную сенсибилизацию стронцием, наблюдается угнетение экспрессии IL-17 после инкубации с металлом ( p <0,05).

Спонтанная продукция α-TNF группы обследования статистически значимо ниже таковой в группе контроля. Уровень стронцийиндуциро-ванной продукции данного цитокина в обследуемой группе также ниже контрольной ( p <0,05) (табл. 2).

Таблица 2

Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов клетками периферической крови школьников, значение медианы (25 - 75-й перцентиль), пг/см³ (эксперимент)

Параметр	Группа	Цитокины
		α-TNF	GM-CSF	VEGF
Спонтанная продукция	Контроль	38,69 (13,19–59,66)	1,25 (0,85–2,38)	124,71 (63,82–199,56)
	Наблюдение	3,62 (2,84–16,08) *	1,88 (0,57–4,50)	84,11 (28,16–170,72)
Продукция, индуцированная стронцием	Контроль	60,41 (32,12–105,87)	23,75 (4,66–44,56)	145,21 (32,00–216,29)
	Наблюдение	7,69 (3,59–20,53) *	3,38 (1,19–13,08) *	79,73 (21,21–115,39)
Индекс влияния
Стронций	Контроль	1,38 (0,72–4,51)	26,26 (4,21–52,43) *	0,84 (0,57–1,13)
	Наблюдение	1,26 (0,86–3,63)	2,26 (0,99–7,77)	0,62 (0,44–1,66)

П р и м е ч а н и е: * – разница достоверна по сравнению с группой контроля при значении p <0,05.

Концентрация GM-CSF, секретируемого спонтанно, в обеих группах не имеет достоверных различий. В условиях активации стронцием происходит стимуляция экспрессии фактора роста, однако у обследуемых детей она достоверно более низкая.

Значение медианы спонтанной концентрации эндотелиального ростового фактора VEGF у детей группы наблюдения ниже, чем в контрольной. Индуцированный синтез фактора более значим в группе контроля.

Проведены исследования влияния стронция на остеометаболизм путем определения содержания медиаторов ремоделирования костной ткани RANKL, остеопротегерина, IL-17, α-TNF, определен дисбаланс у детей, экспонированных стронцием, между маркерами, характеризующийся соотношением RANKL/остео-протегерин, что ассоциируется со сниженной способностью поддерживать формирование и активацию остеокластов (табл. 3).

Отношение RANKL/остеопротегерин у группы наблюдения (0,16 (0,13–0,32)) было выше аналогичного значения у детей группы контроля (0,10 (0,02–0,18)). Также установлено изменение содержания IL-17 в кровотоке, цитокина, одной из функций которого, как маркера иммунной регуляции остеометаболизма, является индукция экспрессии RANKL. Концентрация IL-17 у детей группы наблюдения в 1,29 раза выше, чем в группе контроля. В кровотоке обследованных групп наблюдения отмечается достоверно повышенная концентрация α-TNF по сравнению с контрольной группой.

Отмечается отрицательная корреляция ( r =–0,72; p <0,05) между содержанием стронция и уровнем остеопротегерина. Корелляционные связи между содержанием стронция и уровнем

Таблица 3

Сравнительная оценка содержания маркеров костного ремоделирования в крови школьников, значение медианы (25–75-й перцентиль), пг/ см³

Показатель	Группа
	наблюдения	контрольная
Ampli-sRANKL, пг/см 3	8,48 (3,52–11,71)	5,53 (1,29–13,15)
Остеопротегерин, пг/см 3	20,80 (19,05–48,55)	85,05 (71,13–105,28) *
Ampli-sRANKL/ Остеопротегерин	0,16 (0,13–0,32)	0,10 (0,02–0,18)
Интерлейкин-17, пг/см 3	1,09±0,14	0,85±0,12
α-TNF, пг/см 3	1,57 (1,45–2,245)	0,49 (0,39–0,76) *

П р и м е ч а н и е: * – разница достоверна по сравнению с группой наблюдения при значении p <0,05.

RANKL/oстеопротегерин ( r =0,53; p <0,05) являются положительными.

Отношение RANKL/остеопротегерин в группе наблюдения (у школьников – 0,11) было достоверно выше аналогичного в контрольной группе (0,06).

Выводы. В результате проведенных исследований установлено, что маркеры специфической гиперчувствительности и медиаторы межклеточной иммунной регуляции: IgG специфические к стронцию, цитокины IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, α-TNF, GM-CSF, спонтанные и специфически стимлированные, IL-17, α-TNF в кровотоке, RANKL, OPG могут быть предложены для проведения идентификации риска нарушения здоровья в качестве ранних маркеров нарушений иммунорегуляции у школьников, проживающих в зонах стронциевых геохимических провинций.