Система освещения объекта для микроскопии с субдифракционным разрешением

В последние годы разработано несколько методов сверхразрешения в оптической микроскопии. Разрешающая способность традиционной оптической микроскопии ограничена дифракционным пределом разрешения, составляющим около половины длины волны наблюдаемого излучения [1]. В видимой области спектра этот предел составляет около 200 нм. Наиболее подробно исследованным и часто используемым способом получения оптических изображений с субволновым разрешением является сканирующая ближнепольная оптическая микроскопия (СБОМ) [2, 3]. При помощи СБОМ можно считывать распределение интенсивности света, спектр излучения на поверхности образца с разрешением, гораздо более высоким, чем это позволяет критерий Релея. Однако, сканирующий принцип и необходимость контроля положения зонда вблизи поверхности образца с точностью, выше 50 нм, делают получение изображений этим методом довольно медленным, стоимость микроскопа – высокой, а также накладывают дополнительные требования на свойства образа.

С другой стороны, в последнее время разработано несколько методик получения изображений с высоким разрешением, основанных на оптических принципах, но позволяющих получать информацию не о распределении интенсивности оптических полей, а о распределении красителя (люминофора) в образце, имеющих особое значение для наблюдения биологических объектов.

Метод STED [4] основан на сканировании образца пучком лазера на двух длинах волн и использовании специального красителя, люминесценция которого возбуждается излучением одной длины волны и подавляется излучением на другой длине волны. Другой подход получения сверхразрешения в люминесцентной микроскопии основан на таком возбуждении люминесценции, когда в каждый отдельный момент времени имеет место люминесценция случайно распределенных отдельных молекул красителя, изолированных друг от друга на расстояние, большее предела разрешения оптического микроскопа, в который они наблюдаются [5–7].

Третий подход (SIM) [8] в некотором смысле подобен принципу конфокальной микроскопии [9]. Этот метод основан на освещении образца последовательностью интерференционных картин. Использование нелинейных свойств люминофора в этом методе позволяет добиться повышения

Ассельборн С.А., Зацепин Е.С., Исаков Д.С., Система освещения объекта для микроскопии Герасимов А.М., Пихуля Д.Г., Микляев Ю.В. с субдифракционным разрешением разрешающей способности. Так, в работе [10] сообщалось о достижении разрешающей способности 50 нм в режиме насыщения люминесценции.

Для преобразования ближнепольного изображения в распространяющиеся волны было предложено и реализовано несколько вариантов так называемых дальнепольных суперлинз (far-field superlenses – FSL) и гиперлинз. Часть из них основана на возбуждении эванесцентными волнами волн поверхностных плазмонов [11]. Другой класс таких суперлинз основан на субволновой фокусировке и увеличении изображения при помощи диэлектрических линз и сфер с радиусом кривизны около нескольких микрометров [12, 13]. Изображение получается при очень малом фокусном расстоянии с субволновым разрешением. При таком способе получения изображения область наблюдения является очень малой или состоящей из множества отдельных небольших участков размером не более нескольких микрометров.

Последние результаты в области оптического сверхразрешения связаны с дальнейшим развитием уже существующих методов. Так, в области люминесцентной локализационной микроскопии получены результаты по быстрому сканированию образца за счет использования высокочувствительных камер и уменьшению поля зрения [14], а также оптимизации алгоритмов [15, 16]. Развитие этой техники идет также в направлении получения трехмерных изображений [17] и в получении двухцветных изображений объектов, различные элементы которых абсорбируют различные красители [18]. Новые результаты в зондовой микроскопии связаны с использованием нелинейных эффектов [19, 20] и комбинационного рассеяния [21, 22].

Метод сверхразрешения, рассмотренный в данной статье, основан на подходе, ранее предложенного авторами [23], позволят получать изображения с разрешением, аналогичным методу сканирующей ближнепольной микроскопии, равным 50–100 нм. В отличие от люминесцентной микроскопии изображения объектов получаются не в виде картины распределения красителя, а в виде распределения оптических свойств самого объекта. Отличительной особенностью метода является возможность получения большого поля зрения и сравнительно большой глубины резкости при высоком разрешении. Также возможно получение изображений подвижных объектов, поскольку в данном методе, в отличие от люминесцентной микроскопии, используется динамичная картина движущихся наночастиц. По сравнению с зондовой микроскопией данный метод может обеспечить более высокую скорость сканирования, обусловленную тем, что в роли зондов одновременно используется большое количество наночастиц. Также метод допускает получение трехмерных изображений объектов.

В предложенном нами методе наночастицы, взвешенные в слое жидкости на поверхности объекта, наблюдаются в оптический микроскоп. Определяется координата каждой частицы и интенсивность рассеиваемого ей света. В результате, вычисляется интенсивность света в месте нахождения частицы. Разрешение метода, ограничено, в основном, только размерами частиц, которые могут регистрироваться оптическим микроскопом, и может достигать 10–20 нм. На текущем этапе нами выполнялось сканирование поверхности образца частицами со средним размером менее 120 нм.

Получение изображения в данном методе состоит из следующей последовательности действий:

• 1.    Нанесение суспензии наночастиц на поверхность объекта, в результате суспензия находится между поверхностью объекта и покровным стеклом.

• 2.    Регистрация картины броуновского движения наночастиц с помощью микроскопа и ПЗС камеры.

• 3.    Обработка получаемого видеопотока при помощи специально разрабатываемой программы трассировки частиц, вычисление координат частиц (с субволновой точностью) и определение соответствующей им интенсивности рассеяния.

• 4.    Обработка данных на выходе программы трассировки частиц, и расчет распределения интенсивности ближнего поля с субволновой точностью. Фурье-фильтрация полученного изображения.

Для регистрации броуновского движения наночастиц в суспензии требуется оптическая схема, которая в отличие от обычного оптического микроскопа позволит использовать различные виды источников освещения (в том числе лазерные) как в режиме отраженного, так и в режиме проходящего света.

В ходе работы были получены суспензии частиц золота и диоксида титана в воде. Для предотвращения агрегации частиц и адгезии на поверхность объекта использовался сурфактант. На рис. 1 и 2 показаны распределения частиц по размерам, полученным методом динамического рассеяния на анализаторе размера частиц Microtrac «Nanotrac Ultra» производства компании Microtrac Inc..

Рис. 1. Гистограмма распределения размеров золотых наночастиц в водной суспензии

Рис. 2. Гистограмма распределения размеров наночастиц диоксида титана в водной суспензии

На данном этапе исследований была выполнена разработка алгоритма обработки видео, позволяющих получать изображения с субдифракционным разрешением до 50 нм. Исследована функциональность метода на различных тестовых объектах.

Для увеличения яркости изображения наночастиц с размерами меньше 90 нм в качестве источника освещения использовался непрерывный лазер с устройством для подавления когерентности. Регистрация броуновского движения проводилась с помощью стандартной черно-белой ПЗС камеры повышенной чувствительности, так и с помощью сверхвысокочувствительной камеры на основе EMCCD детектора (Andor iXon Ultra).

На рис. 3 показаны изображения наночастиц золота со средним размером 29 нм, полученные при помощи лазерной подсветки.

Рис. 3. Снимок наночастиц золота со средним размером 29 нм, полученный в темном поле при помощи лазерной подсветки. Числовая апертура объектива NA = 0,75

Для обработки видеоряда была разработана программа трассировки частиц. В этой программе использован алгоритм, позволяющий, в первую очередь, обеспечить высокую скорость вычислений, в том числе за счет использования встроенного набора инструкций процессора, и, во вторую очередь, обеспечивающий приемлемую точность локализации наночастиц. Для этой цели наиболее хорошо подходит метод аппроксимации изображения наночастицы гауссовой поверхностью [24]. Последовательность обработки видеоряда программой можно описать следующим образом: выделение динамической составляющей (удаление статической составляющей изображения), подавление шумов и подготовка изображений видеоряда к распознаванию частиц, поиск и распознавание частиц (корреляционным методом), определение координат центров частиц с субпиксельной точностью (методом аппроксимации с гауссовой поверхностью), определение яркости частиц, компенсация пространственного дрейфа изображения в видеоряде.

После получения изображения на основе данных трассировки частиц, полученное изображение обрабатывается методом Фурье-фильтации. Для построения Фурье-фильтра использованы измерения амплитудно-частотной характеристики данного метода получения изображений.

Схема экспериментальной установки для получения изображения наночастиц в проходящем свете при использовании лазерной подсветки представлена на рис. 4. Данная экспериментальная установка разработана на основе модульного микроскопа. В схеме используется лазер на длине волны 532 нм и сверхвысокочувствительная камера Andor iXon Ultra. Фото установки показано на рис. 5.

Рис. 4. Схема лазерного освещения объекта. КЛ1 и КЛ2 – коллимирующие линзы

Рис. 5. Фотография установки микроскопии со сверхразрешением на основе модульного микроскопа с лазерной подсветкой и высокочувствительной камерой Andor iXon Ultra. В правом нижнем углу фото диффузор – устройство для подавления пространственной когерентности в системе лазерного освещения объекта

При помощи данной установки были получены изображения тестовых объектов, показанные на рис. 6, 7. Тестовый объект на рис. 6 представлял собой полоски хрома толщиной около 50 нм на кварцевой подложке, тестовый объект на рис. 7 – ряд отверстий диаметром 100 нм в пленке титана на кварцевой подложке.

а)

б)

Рис. 6. Изображение объекта, и построенное по

в)

г)

видимое в объектив микроскопа а), в), трассировке наночастиц б), г)

Как можно видеть из сравнения фото в ) и г ), сканирование наночастицами позволяет не только повысить четкость изображения, но и выявить новые детали изображения.

На рис. 7 показано сравнение изображений тестового объекта с дополнительной математиче- ской обработкой видеоряда, позволяющей компенсировать дрейф изображения в процессе съемки (рис. 7, а) – без компенсации, рис. 7, б) – с компенсацией). Дело в том, что с учетом высокого разрешения получаемого изображения даже небольшие перемещения объекта под микроскопом приводят к снижению разрешения. В данном случае такая матобработка демонстрирует возмож- ность получения изображения со сверхразрешением движущихся объектов.

а)

б)

Рис. 7. Изображение без компенсации дрейфа объекта ( а ) и с дополнительной математической обработкой, учитывающей этот дрейф ( б )

Кроме алгоритма определения координаты наночастицы на плоскости с субдифракционной точностью, в данной работе был разработан алгоритм, позволяющий определять положение наночастиц в объеме (все три координаты). Данный подход основан на обработке изображения наночастиц при их наблюдении в микроскоп с введенным астигматизмом. Использовалась схема микроскопа, показанная на рис. 8.

Рис. 8. Схема модифицированного микроскопа для получения астигматического изображения наночастиц. В микроскоп дополнительно помещалась цилиндрическая линза с фокусным расстоянием 2 м непосредственно перед тубусной линзой с фокусным расстоянием 180 мм

Дополнительная цилиндрическая линза, помещенная между объективом и тубусной линзой, приводила к формированию астигматического изображения наночастиц, эксцентриситет которого определялся вертикальным положением наночастицы. Снимок суспензии наночастиц, нанесенной непосредственно на плоскую поверхность (после испарения жидкости) показан на рис. 9.

Определение эксцентриситета изображения наночастицы в каждый момент времени позволило вычислить все три координаты наночастиц. Данный подход позволяет выделить частицы, расположенные в непосредственной близости от поверхности объекта и на основе этого повысить контраст получаемого двумерного изображения. Это обусловлено тем, что таким образом можно учитывать только вклад частиц, находящихся в области ближнего поля.

Кроме того, данный способ позволяет определять трехмерный рельеф поверхности объекта. На данном этапе нами были проведены исследования для случая плоской поверхности (границы допустимой области для частиц). Было проведено сканирование наночастицами при различных наклонах поверхности объекта и вертикальном смещении поверхности объекта.

Результаты расчетов координат частиц показаны на рис. 10.

Рис. 9. Наночастицы на плоской поверхности, полученный при астигматизме изображения на микроскопе Olym-

pus BX51 с объективом 20x, NA=0,4 и фокусном расстоянии цилиндрической линзы, равном 2 м. Во втором случае поверхность наклонена относительно вертикальной оси. Левая сторона поверхности расположена ближе, а правая – дальше от объектива. Это приводит к тому, что эксцентриситет изображений частиц отличается в левой и правой стороне снимка

Рис. 10. Распределение координат частиц в объеме суспензии. Вертикальная координата горизонтальной поверхности объекта равна 5 мкм. Количество зарегистрированных частиц равно 6 000

Точность измерений вертикальной координаты определялась по величине разброса при исследовании изображений частиц после испарения жидкости и вертикальном смещении объекта. Точность определения вертикальной координаты составила около 200 нм при диапазоне измерений, равном 30 мкм.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что использование лазерной подсветки и высокочувствительной камеры в методе сканирования ближнего поля при помощи наночастиц позволяет получать двумерные изображения с разрешением около 50 нм и с точностью 200 нм по вертикали определять рельеф объекта. Кроме построения рельефа объекта данная информация может быть использована для дискриминации частиц по высоте или удаленности от поверхности объекта и получения более четкого изображения.

Исследование поддержано Грантом РФФИ по проекту № 20-42-740008.