Система «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» у мышей с экспериментальным раком шейки матки при воздействии ВКР-лазера

Введение.¹ Высокоинтенсивное лазерное излучение (ЛИ) используется в хирургии для нанесения поверхностных и глубинных разрезов, испарения поверхностных дефектов кожи, коагуляции и карбонизации тканей, их стерилизации. В ряде работ показана перспективность использования высокоинтенсивного лазерного излучения вынужденного комбинационного рассеивания (ВКР) для лечения онкологических заболеваний [1, 8]. В течение нескольких лет активно рассматривается идея, согласно которой инфракрасный свет инициирует фотохимические реакции, напрямую возбуждая молекулы кислорода в биологических системах [9, 10, 12, 13]. При этом происходит фотогенерация синглетного кислорода, который может участвовать в цепных свободнорадикальных реакциях, вызывать окисление белковых молекул, инициировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). Результатом такого воздействия может стать гибель клеток путем некроза или апоптоза.

Мощным источником излучения, способным эффективно работать в этой области, может служить ВКР-лазер с накачкой от иттербиевого волоконного лазера [11]. Показано, что максимальная генерация синглетного кислорода достигается при облучении на длине волны 1264–1270 нм [8]. При этом ширина спектра действия по полувысоте составляет 15–20 нм. Показана исключительная перспективность использования таких излучателей для лечения онкологических заболеваний [6].

Данные о влиянии ЛИ на целостный организм представляются значимыми при разработке схем его использования в терапии опухолей. В наших исследованиях показано, что непрерывное облучение ВКР-лазером в дозе 1 кДж/см2 мышей с экспериментальным раком шейки матки (РШМ) стимулирует возникновение оксидативного стресса в неоплазме [2]. Однако мы не оценивали влияние используемых доз облучения на целостный организм.

Цель исследования. Оценка влияния непрерывного высокоинтенсивного лазерного излучения с рабочей длиной волны 1265 нм на редокс-зависимые процессы в организме-опухоленосителе.

Материалы и методы. Работа выполнена на белых беспородных мышах (n=96) с экспериментальным раком шейки матки (РШМ-5, опухолевый штамм из НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН). Облучение начинали на 18–20-е сут в стадии интенсивного роста опухоли (средний объем опухоли составлял 0,55 см³).

Источником ЛИ явился непрерывный волоконный лазер, генерация в котором осуществляется в процессе вынужденного ком- бинационного рассеяния, с длиной волны 1265 мкм, являющийся совместной разработкой Института общей физики РАН и Центра нанотехнологий Ульяновского государственного университета. В качестве среды преобразователя использовалось стандартное телекоммуникационное волокно. Максимальная непрерывная выходная мощность используемого излучения составила около 4 Вт на длине волны 1265±3 нм. Соответствующий спектр излучения представлен на рис. 1.

Рис. 1. Спектр излучения ВКР-лазера

Для облучения мышей фиксировали на расстоянии 30 см от объекта излучения. Зону облучения выстригали. Средняя интенсивность излучения составляла 0,177 Вт/см2, что значительно ниже границ перехода нетеплового действия к термическому (0,5–1 Вт/см2). Последнее исключает тепловые эффекты лазерного воздействия в указанном диапазоне.

Плотность энергии ЛИ, поглощаемого биотканью (Э, Дж/см2), с учетом большей (по сравнению с глубиной проникновения ЛИ, составляющей на длине 1265 нм менее 1,5 мм) толщины облучаемой биоткани рассчитывалась из соотношения

Э=Pt/S, где P – средняя мощность излучения, Bт; t – время облучения, с; S – площадь лазерного пятна на биоткани, см2.

При облучении в течение 10 мин доза высокоинтенсивного излучения составляла 0,1 кДж/см2, а при 2-минутном облучении – 0,02 кДж/см2. Таким образом, суммарная до- за 10 сеансов в первом случае составила 1 кДж/см2, а во втором – 0,2 кДж/см2.

Через сутки после последнего облучения животные выводились из эксперимента под эфирным наркозом. Эксперимент проводился в соответствии с положениями Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.

Уровень перекисного окисления липидов в эритроцитах и плазме оценивался по содержанию малонового диальдегида (МДА). Для оценки антиоксидантной системы (АОС) биохимически оценивали активность супер-оксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатион-редуктазы (ГР) и глутатион-S-трансферазы (ГТ).

Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Различия между группами считали достоверными при р≤0,05.

Результаты и обсуждение. Одним из условий развития и роста злокачественной опухоли является перестройка свободнорадикальных процессов в организме [2, 7]. Нами установлено, что при экспериментальном раке шейки матки в эритроцитах и плазме крови (табл. 1, 2) повышен уровень МДА. При этом в эритроцитах увеличивается активность ГТ, ГР и каталазы, в плазме увеличивается активность каталазы и ГТ (табл. 1, 2), что свидетельствует о переходе системы ПОЛ–АОС на более высокий уровень функционирования [5] и не позволяет предполагать развитие оксидативного стресса.

В результате проведенных исследований также было установлено, что непрерывное лазерное облучение на длине волны 1265±3 нм в дозах 0,2 и 1 кДж/см2 контрольных мышей приводит к достоверному дозозависимому увеличению уровня МДА в эритроцитах при одновременном повышении активности ферментов АОС (табл. 1).

У мышей с РШМ облучение лазером ВКР в дозе 0,2 кДж/см2 в эритроцитах статистически значимо снижает уровень МДА, активность ГТ и каталазы. При этом уровень СОД и ГР колеблется в пределах коридора нормы. Снижение активности ферментов АОС коррелирует с падением уровня МДА (r=0,0257, p<0,5). Можно предположить, что в условиях усиленной пероксидации мембран эритроцитов снижение содержания МДА могло быть вызвано усилением его связывания с мембраной, активацией альдегиддегидрогеназы, участвующей в метаболизме МДА в эритроцитах [4]. При облучении в дозе 1 кДж/см2 уровень МДА и активность ферментов АОС в эритроцитах мышей достоверно не изменяются (табл. 1).

Таблица 1

Показатели системы ПОЛ-АОС в эритроцитах здоровых мышей и мышей с РШМ-5 после облучения ВКР-лазером

Экспериментальная группа		МДА, мкмоль/л	СОД, у.е.	Каталаза, моль/с/л	ГР, ммоль/мин/л	ГТ, ммоль/мин/л
Контрольные мыши, n=48	без облучения	219,65±7,57	1,46±0,10	17,13±0,64	0,43±0,03	0,14±0,02
	0,2 кДж/см2	279,66±13,32*	2,04±0,12*	55,51±4,62*	0,53±0,04*	0,26±0,01*
	1 кДж/см2	376,07±16,78*	1,64±0,18	74,32±18,56*	0,52±0,04*	0,24±0,03*
Мыши с РШМ-5, n=48	без облучения	325,94±14,36	1,46±0,14	60,09±3,02	0,61±0,06	0,56±0,06
	0,2 Дж/см2	260,86+18,22*	1,22±0,23	49,41±1,77*	0,72±0,09	0,18+0,01*
	1 кДж/см2	318,50±27,91	1,25±0,12	65,93±6,04	0,78±0,09	0,70±0,08

Примечание. * – данные, статистически значимо отличающиеся от данных до облучения.

У контрольных мышей при облучении в дозе 0,2 кДж/см2 в плазме крови наблюдается значительное повышение уровня МДА при одновременном повышении ГТ и неизменной активности остальных ферментов АОС. Доза в 1 кДж/см2 вызывает значимое увеличение уровня МДА и снижение активности АОС в плазме крови контрольных мышей (табл. 2), что позволяет предполагать развитие выраженного оксидативного стресса.

Заключение. Таким образом, степень выраженности воздействия ВКР-лазерного излучения на длине волны 1265 нм на редокс-зависимые процессы в организме с РШМ напрямую зависит от дозы облучения. Излучение ВКР-лазера в дозе 1 кДж/см² инициирует развитие оксидативного стресса у мышей с РШМ, не вызывая нарушения функционирования системы ПОЛ–АОС в организме здоровых животных.

Таблица 2

Показатели системы ПОЛ-АОС в плазме крови здоровых мышей и мышей с РШМ-5 после облучения лазером ВКР-лазером

Экспериментальная группа		МДА, мкмоль/л	Каталаза, моль/с/л	ГР, ммоль/мин/л	ГТ, ммоль/мин/л
Контрольные мыши, n=48	без облучения	2,95±0,24	0,100±0,019	0,014±0,004	0,016±0,003
	0,2 кДж/см2	3,82±0,20*	0,104±0,037	0,016±0,008	0,033±0,005*
	1 кДж/см2	1,03±0,00*	0,040±0,007*	0,019±0,003	0,006±0,002*
Мыши с РШМ-5, n=48	без облучения	6,23±0,31	0,172±0,061	0,005±0,001	0,038±0,003
	0,2 Дж/см2	1,82±0,46*	0,070±0,040*	0,022±0,004*	0,036±0,004
	1 кДж/см2	10,70±1,26*	0,099±0,060	0,005±0,001	0,035±0,002

Примечание. * – данные, статистически значимо отличающиеся от данных до облучения.

токислородный эффект в онкологической практике / А. С. Юсупов, С. Д. Захаров // Креативная хирургия и онкология. – 2011. – № 2. – Р. 24–32.

• 7.    Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньщикова [и др.]. – М. : Слово, 2006. – 556 с.

• 8.    Cancerous cell death from sensitizer free photoactivation of singlet oxygen / F. Anquez [et al.] // Photochem. Photobiol. – 2012. – Vol. 167. – P. 201–288.

• 9.    Infrared laser pulse triggers increased singlet oxygen production in tumour cells / S. G. Sokolovski // Scientific Reports. – 2013. – № 3. – Р. 3484.

• 10.    Raman fiber laser for the drug-free photodynamic therapy / A. S. Yusupov [et al.] // Laser Physics. – 2010. – Vol. 20. – P. 357.

• 11.    Ramanlaser based on a fiber with variable mode structure / A. E. Bednyakova [et al.] // Laser Phys. – 2011. – Vol. 21. – P. 290.

• 12.    Schweitzer C. Physical mechanisms of generation and deactivation of singlet oxygen / C. Schweitzer, R. Schmidt // Chem. Rev. – 2003. – Vol. 103. – P. 1685.

• 13.    Solvent dependence of the steady-state / A. A. Krasnovsky [et al.] // Chem. Phys. Lett. – 2006. – Vol. 430. – P. 260.

• 14.    Zakharov S. D. Light-oxygen effect as a physical mechanism for activation of biosystems by quasi-monochromatic light / S. D. Zakharov, A. V. Ivanov // Biophysics. – 2005. – Т. 50, № l. – С. 64.

SYSTEM «LIPID PEROXIDATION – ANTIOXIDANT» MICE WITH EXPERIMENTAL CERVICAL CANCERON EXPOSURE RAMAN LASER

O.S. Voronova, D.R. Dolgova, T.V. Abakumova, I.O. Zolotovsky, I.I. Antoneeva

Ulyanovsk State University