Систематическое положение Papaver popovii Sipl. среди маков Байкальской Сибири на основе молекулярно-генетических исследований

Бадмаева Н. К., Ешисамбуева Н. Б., Бухарова Е. В., Намзалов Б-Ц. Б. Систематическое положение Papaver popovii Sipl. среди маков Байкальской Сибири на основе молекулярно-генетических исследований // Вестник Бурятского государственного университета. Биология, география. 2019. № 2. С. 5–14.

Вид Papaver popovii Sipl. впервые описан В.Н. Сипливинским по его собственным сборам 8.09.1971 г. с острова Мохнатый Калтыгей в Чивыркуйском заливе оз. Байкал (Сипливинский, 1973). Изотип хранится в гербарии П.Н. Крылова (ТК), дубликат хранится в гербарии LE, Ботанического института (Гуреева, Балашова, 2017).

P. popovii — узколокальный эндемик побережий оз. Байкал, является ледниковым реликтом (Попов, Бусик, 1966) и краснокнижным редким охраняемым видом. В Бурятии отмечен в Баргузинском районе в Чивыркуйском заливе на островах Лохматый и Голый Кылтыгей. Вне Бурятии в Иркутской области обнаружен в нескольких пунктах Ольхонского района: мысы Уюга, Зундук, Шартлай, Рытый и на острове Ольхон — мыс Хобой и Саган-Хушун (Красная книга Республики Бурятия …, 2002; Красная книга Иркутской …, 2010; Красная книга Республики Бурятия …, 2013).

На острове Лохматый Кылтыгей отмечена популяция P. popovii площадью около 400 кв. м. Структура популяции полночленная, отмечается семенное возобновление. Плотность ценопопуляций — до 3 особей на 1 кв. м. Лимитирующими факторами, возможно, являются экзогенные факторы, такие как, эрозия каменисто-щебнистых склонов, усиление рекреационной нагрузки на местообитания.

Вид охраняется в пределах Забайкальского национального парка (Аненхонов, Пыхалова, 2010). Вне Бурятии большинство известных в Иркутской области популяций взяты под охрану в Байкало-Ленском заповеднике, Прибайкальском природном национальном парке и комплексном памятнике природы областного значения «Мыс Хобой» (Красная книга Иркутской …, 2010).

P. popovii многолетнее травянистое рыхлодерновинное растение (рис. 1). Листья на длинных тонких черешках, разреженно беловолосистые, пластинки в 2–2,5 раза короче черешков, яйцевидные, дважды перисторассеченные, доли листьев продолговатые или яйцевидные, глубоко, почти до основания, надрезанные на линейно-ланцетные дольки. Цветоносы 12–45 см высотой, прижато опушенные светлыми волосками. Чашелистики густо опушены темно-бурыми или рыжеватыми волосками. Цветки 3–6 см диаметром, чаще белые, реже серно-желтые. Коробочки 1,0–1,5 см длиной, продолговато-обратнояйцевидные, с рассеянными светлыми или слегка рыжеватыми щетинками, иногда почти голые (Флора Сибири, 1994).

Рис. 1. Papaver popovii Sipl. Чивыркуйский залив, остров Лохматый. Мак Попова на крутых каменистых склонах с группировками Draba hirta L., Cortusa sibirica Andrz. и других. (Фото Е. В. Бухаровой)

В систематике рода Papaver L. много вопросов, связанных с таксономией. Некоторые морфологические признаки сильно варьируют в зависимости от экологических условий. Хотя количество видов, произрастающих на территории Байкальской Сибири невелико, высок процент эндемиков от общего числа видов (Флора Сибири, 1994; Малышев, Пешкова, 1984).

Во «Флоре СССР» (1937) род обработан М. Г. Поповым и число таксонов составляет 52, из них 8 видов отмечалось в Восточной Сибири. С К. Черепанов (1995) указывает 99 таксонов рода Papaver для России и сопредельных государств, из них 26 таксонов приводятся для Восточной Сибири. Во «Флоре Сибири» (1994) в обработке Г. А. Пешковой род представлен 32 таксонами. По «Определителю растений Бурятии» (2001) в обработке К. И. Осипова 12 видов встречаются в Западном Забайкалье. По «Конспекту Флоры Азиатской России» (2012) 18 таксонов указаны для Байкальской Сибири.

Материалы и методы.

ДНК выделен из 11 гербарных образцов 8 таксонов (Таблица 1.). Ваучерные гербарные образцы хранятся в гербарии UUH.

Молекулярно-генетические исследования проводились по общепринятым протоколам с индивидуальным подбором праймеров и условий амплификации.

Тотальную ДНК выделяли из 20 мг высушенных в силикагеле образцов с использованием кита «NucleoSpin Plant II Kit» (Macherey-Nagel, Германия) по стандартному протоколу производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в термоциклере BIO-RAD Т100TM (BIO-RAD, США).

Таблица 1

Список образцов для молекулярно-генетического исследования

№      Виды	Происхождение образца (ваучер)
1 P. nudicaule L.	Гербарий высших растений Иркутского госуниверситета РБ. Кяхтинский р-н, 3,8 км ЮВ с. Мурочи грядовые пески. Н. А. Дулепова
2 P. nudicaule L.	Гербарий высших растений Иркутского госуниверситета. РБ. Селенгинский р-н, у парома через р. Чикой, в районе впадения его в Селенгу. 12.06.2006 г. Соб.: И. Евтушенко, Е. Ведерникова. Опр.: Н. А. Дулепова
3 P. croceum	ИОЭБ СО РАН Гербарий UUH . Восточный Саян, Китой-ские Гольцы, левобережье Горлык-Гола, верх. ключа Зеленого. h-2300 м., альпийский луг. Соб.: Шумкин В. П. 30 июля 2002г.
4 P. popovii Sipl.	ИОЭБ СО РАН Гербарий UUH. Баргузинский р-н, Чи-выркуйский залив, о. Большой Калтыгей, N 53°48.930, E 109°05.063, Крутой каменистый склон. Соб.: Бадмаева Н.К. 5.07. 13.
5 P. czekanovskii	ИОЭБ СО РАН Гербарий UUH . Баунтовский район долина реки Горбылок Глинисто песчаный берег. Г. А. Пешкова, 1991.
6 P. nudicaule L.	Гербарий высш. раст. Иркутского госуниверситета. РБ, Би-чурский р-н, 10 км СВ от пос. Окино-Ключи, лев. берег р. Хилок. Парковый ильмовник в пойме реки. 14.06.2006 Собрал: В. Чепинога, А. Фролов; Определил: Н. А. Дулепо-ва. №16107
7 P. olchonense Peshkova	Гербарий Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (Ирк) Иркутская область, Ольхонский р-н, поб-е оз. Байкал, мыс. Уюга, Галечниковый перешеек. 4.09.2010 г. Соб.: Д. А. Кривенко, Е. С. Преловская. 15.11.2010 г. Опр: С. Г. Казановский
8 P. rubro-aurantiacum Ficher ex R.Sweet	Гербарий UUH Института биологии БФ СО АН СССР. РБ. Кабанский р-н, степь. Соб.: Т. Г. Бойков
9 P. rubro- aurantiacum Ficher ex R.Sweet	ИОЭБ СО РАН Гербарий UUH. РБ Еравинский р-н. Долина р.Зазы, в 5 км к сев.-востоку от устья р. Ехэ Горхон, 982 м. N 53°12/351” E 111°48.960”. Злаково-разнотравная степь Соб. и опр.: О. А. Аненхонов, 2008
10 P. psedocanescene	Гербарий UUH Института биологии БФ СО АН СССР. РБ. Окинский р-н долина р. Китой, 10 км к зап. От устья р. Са-тан-Сойр на песчаной осыпи. Соб. и опр.: О. А. Аненхонов 24.08.1992
11 P. setosum	Гербарий UUH Института биологии БФ СО РАН СССР РБ, хр. Улан-Бургасы, долина р. Мостовая, опушка леса. Соб. и опр.: Т. Г. Бойков 11.07.1986

Амплификация ДНК для участка ITS1-5.8S-ITS2 рДНК проводилась в растворе объемом 20 мкл, содержащем 2 мкл 10х Tag -буфера; 2 мкл 25 мМ MgCl₂ (финальная концентрация — 2,5 mM); 2 мкл 10 мМ dNTPs (финальная концентрация — 0,2 мМ); 1 мкл DMSO (4%); 1 мкл 10 пмоль прямого (F) и 1 мкл 10 пмоль обратного (R) праймеров; 8,7 мкл стерильной деионизированной воды (dd H₂O); 0,3 мкл Tag -полимеразы (5 ед/мкл); 2 мкл геномной ДНК (20–40 нг/мкл) (реактивы и праймеры фирмы «Синтол», Россия). Участок ITS1-5.8S-ITS2 рДНК ампли-фицировали с использованием праймеров: ITS1 (F), ITSB (R) и ITS2 (R) (табл. 3) в программе по A. Gardiner et all. (2005). ПЦР-продукты визуализировали в 1%-ном агарозном геле с использованием SybrGreen (фирмы «BioDye» Москва, Россия) при 4 В/см. Амплификат очищали набором Mini Elute PCR Purification Kit (Qiagen, Германия). Концентрацию ДНК измеряли флюориметром Qubit (Invitrogen, США). Секвенирование ITS1-5.8S-ITS2 рДНК выполнялось по методу Сэнгера на базе «Синтол» (Москва). Последовательности выравнивали вручную в программе BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999). Филогенетическое дерево на основе ITS1–5.8S–ITS2 региона построено в программе Winclada, с применением программы Nona.

Результаты и обсуждение

Для определения уровней межвидового полиморфизма, и определения взаимоотношений между видами и точного идентифицирования образцов, был использован метод, основанный на применении ISSR-анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов с ISSR-праймерами. Для ISSR-анализа видов исследуемого рода был проведен предварительный поиск рабочих праймеров. Были протестированы 17 ISSR-праймеров. Длина праймеров составила от 11 п.н. до 18 п.н., температура отжига от 36 до 58,7 °С. Из них были выбраны пять праймеров, которые дали наибольшие количество ампликонов в пределах от 200 до 1500 пар нуклеотид: 17898A, 17898B, UBC-857, UBC-818, 835-B. В таблице 2 даны характеристики рабочих праймеров.

Таблица 2

Характеристика праймеров для амплификации ISSR

Праймер*	Нуклеотидная последовательность 5’-3’	Формула	Tемп-ра отжига, ºС.
17898A	CACACACACACAAC	(CA)6AC	42
17898B	CACACACACACAGT	(CA)6GT	42
UBC857B	ACACACACACACACACTG	(AC)8TG	36
UBC818	CACACACACACACACAG	(CA)G	36
UBC835B	AGAGAGAGAGAGAGAGTT	(AG)8TT	52

*Праймеры синтезированы в компании «Евроген» (Москва).

ВЕСТНИК БУРЯТСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

БИОЛОГИЯ, ГЕОГРАФИЯ

Рис. 2. Гель с праймера 835-В. L — мол. линейка. Номера образцов даны выше в тексте.

На рисунке 2. показана наиболее информативная гель-электрофорез с праймера 835-В. При обработке пяти гелей была составлена бинарная матрица, где отсутствие ампликона обозначали «0», присутствие «1». На основании полученной матрицы с пяти праймеров с использованием методов иерархического кластерного анализа (UPGMA) в программе «Статистика» и ближайщего связывания в программе TreeconW 3.2 определены генетические расстояния между видами и построены дендограммы, отражающие взаимоотношения анализируемых видов рода Papaver (рис. 3 и 4).

Я7

P setosiun 11

P.pseudocaneiwcens 10

Р rubio-aui antiaaun 9

P.rubro-aurantiaaun 8

Pokhoneiwe 7

Pnudicaule 6

P cioceiun 3

я

P czekanowskit 5

P poponi 4

P imditaule 2

Pnudicaule 1

Рис. 3. ISSR-дендрограмма построенная при помощи кластерного анализа UPGMA, показывающее взаимоотношения 8 видов рода Papaver Западного Забайкалья.

Рис. 4. ISSR-дендрограмма построенная по методу ближайшего связывания, показывающее взаимоотношения 8 видов рода Papaver Западного Забайкалья.

Обе ISSR-дендрограммы дали более-менее одинаковые результаты. Так, например, на обеих дендрограммах P. pseudocanescens (обр.10) группируется в одном кластере с P. setosum (обр.11). И особенно выделяется P. olchonense (обр.7), он образует свой отдельный кластер. На UPGMA дендрограмме хорошо выделяется две большие клады, образцы видов P. nudicaule (обр.1) (Кяхтинский район), P. nudicaule (обр.2) (Селенгинский район), P. croceum (обр.3) (Восточный саян), P. popovii (обр.4) (Баргузинский район), P. czekanowskii (обр.5) (Баунтовский район), P. nudicaule (обр.6) (Бичурский район) вошли в первую кладу. А образцы видов P. rubro-aurantiacum (обр.8–9) (Еравинский район, Кабанский район), P. pseudocanescene (обр.10) (Окинский район), P. setosum (обр.11) (Хр. Улан-Бургасы) составили вторую кладу, также вторая клада распадается еще на две маленькие субклады. Два образца вида P. rubro- aurantiacum (обр.8–9) из Кабанского и Еравнинского районов объединяются в одну субкладу. Образцы P. pseudocanescens (обр.10) из Окинского района и P. setosum (обр.11) c хр. Улан-Бургасы группируются в первую маленькую субкладу. P. popovii (обр.4) и P. czekanowskii (обр.5) объединяются в одну субкладу.

Следует указать, что филогенетическое дерево, построенное на основе ITS1– 5.8S–ITS2 подтверждает данные, полученные на основе деревьев ISSR-гелей (рис. 5).

В целом, полученные нами результаты позволяют сделать некоторые выводы о родственных связях в изученной группе видов. Образцы вида P. rubro-aurantiacum из Кабанского и Еравнинского райнов и P. pseudocanenscens (Окинский район долина реки Китой), P. setosum (Хр. Улан-Бургасы, долина р. Мостовая) объединяются в одну кладу, что доказывает родственные отношения.

Tree Diagram for Variables

Single Linkage Euclidean distances

Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное на основе ITS1–5.8S–ITS2 региона, показывающее взаимоотношения изученных видов рода Papaver.

На основании полученного филогенетического дерева на основе последовательностей ITS1–5.8S–ITS2, можно утверждать, что P. popovii (Баргузинский район, Чивыркуйский залив, о. Большой Калтыгей), является эндемиком и самостоятельным таксоном, и в то же время близок с эндемиком P. olchonense (Иркутская область, Ольхонский район, маломорское побережье оз. Байкал, мыс. Уюга). Анализ дерева также подтвердил самостоятельность таких видов, как P. rubro-aurantiacum, P. croceum, P. czekanowskii.

Образцы вида P. nudicaule 1 (Кяхтинский район), P. nudicaule 2 (Селенгинский район), P. nudicaule 6 (Бичурский район) на древе не объединились в одну кладу. ISSR– и ITS–анализы показали неоднородность 3-х образцов P. nudicaule из разных районов, морфологически эти образцы также сильно отличались. Нельзя сделать окончательные выводы и по таким видам, как P. pseudocanescens и P. setosum , которые группируются в одну кладу.