Сканирующий микроскоп ионной проводимости с одновременной визуализацией поверхности образца в полуконтактной силовой моде

Открытие сканирующего туннельного микроскопа в 1981 г. [1] привело к появлению нового метода диагностики материалов различной природы с нанометровым уровнем пространственного разрешения, получившего название сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ). В настоящее время СЗМ насчитывает несколько десятков методик, основанных на взаимодействии острого твердотельного зонда с образцом в процессе сканирования вблизи его поверхности. В зависимости от природы детектируемого взаимодействия различают туннельную микроскопию, атомно-, электро-и магнито-силовую микроскопии, оптическую микроскопию ближнего поля и т. п. [2]

В последнее время большой интерес вызывает исследование мягких объектов биологической природы, в частности клеток в нативном состоянии. Для исследования с субмикронным разрешением биологических клеток, находящихся в функциональном растворе, разработана методика, получившая название сканирующей микроскопии ионной проводимости (СМИП) [3]. Принцип работы СМИП основан на использовании в качестве зонда стеклянной микропипетки (МП), регистрирующей ионный ток, протекающий через ее внутреннее отверстие с радиусом r0 ~ (100–500) нм. Такая разновидность СЗМ позволяет исследовать мягкие биологические объекты, функционирующие в жидкой среде с ионной проводимостью, а также поверхность твердых диэлектриков, находящиеся в растворе электролита, например визуализировать поры в искусственных мембранах. Используя СМИП [4], можно получить детальную информацию о функционировании биологических клеток с нанометровым уровнем пространственного разрешения. Как показано в [5], латеральное разрешение СМИП главным образом определяется размером открытой полости МП и имеет величину ~ 3 r0.

До настоящего времени зонд в виде МП использовался только для измерений в режиме СМИП. Целью данной работы было создание и исследование зондового датчика на основе МП, позволяющего визуализировать объект, находящийся в жидком электролите, как в режиме СМИП, так и в режиме силовой микроскопии.

ПРИНЦИП РАБОТЫ СМИП

Принцип работы СМИП показан на рис. 1. Непроводящий образец помещается в стеклянную или пластмассовую чашечку с электролитом и размещается на сканере СЗМ. Зондовый датчик в виде заполненной электролитом МП устанавливается над поверхностью образца. В качестве электролита может выступать физиологический раствор или раствор хлорида натрия (калия). Во внутреннюю полость МП вставлен электрод в виде тонкой Ag проволоки, покрытой слоем AgCl. С внешней стороны МП располагается второй Ag /AgCl-электрод, к которому прикладывается напряжение смещения V 0 , поддерживающее ионный ток между внутренним и внешним электродами. Вдали от поверхности образца ионный ток I максимален и не зависит от величины зазора между образцом и торцом МП. Величина ионного тока сквозь МП [6] определяется ее геометрией, напряжением смещения V ₀ и проводимостью электролита σ :

Рис. 1. Схема сканирующего микроскопа токов ионной проводимости.

1 — микропипетка (в разрезе); 2 — непроводящий образец; 3 — 3D сканер; 4 — проводящие электроды; ПТН — преобразователь ток-напряжение; ДУ — дифференциальный усилитель; ПИД — ПИД-регулятор; ВВУ — высоковольтный усилитель

Рис. 2. Расчетная модель СМИП.

r 0 — внутренний радиус микропипетки, d — толщина стенки микропипетки; z — расстояние между торцом микропипетки и поверхностью образца; h — высота ступеньки на поверхности образца; а — расстояние от ступеньки до границы с диэлектриком в плоскости образца; b — расстояние от поверхности образца до проводящих электродов; 1 — граничная линия, соответствующая электрическому потенциалу φ = 0.2 eV на внешнем электроде; 2 — граничная линия, соответствующая нулевому электрическому потенциалу φ = 0 на внутреннем электроде; 3 — линия границы c диэлектриком, соответствующая условию j·n = 0, n — нормаль к линии границы с диэлектриком, j — вектор плотности ионного тока

I = V у anr G -tg( a ), (1)

здесь r 0 и α — радиус внутреннего отверстия и угол сходимости МП соответственно. На Ag/AgCl-электроде ионный ток трансформируется в электронный ток и с помощью преобразователя ″ток-напряжение″ преобразуется в напряжение V = k ∙ I ( k — коэффициент преобразования). При приближении МП к поверхности образца на расстояния, сравнимые с величиной r 0 , ионный ток начинает уменьшаться. Для стабилизации ионного тока при малых расстояниях между поверхностью образца и торцом МП используется следящая система (СС) с отрицательной обратной связью. Напряжение V сравнивается с опорным напряжением V ref , сигнал ошибки V – V ref преобразуется с помощью ПИД-регулятора, усиливается и прикладывается к сканеру, смещающему образец вдоль оси МП. В режиме СМИП осуществляется сканирование образцом на малых расстояниях от торца МП при постоянном значении ионного тока. В результате МП считывает микрорельеф поверхности диэлектрического образца, находящегося в растворе электролита, не касаясь поверхности образца.

МОДЕЛИРОВАНИЕ СМИП-ИЗОБРАЖЕНИЯ

Для оценки пространственного разрешения и контраста метода моделировалось СМИП-изображение образца в виде одномерной ступеньки высотой h на диэлектрической поверхности (рис. 2)

z s ⁽ x ) =

0,

- h ,

при G <  x <  а , при a <  x <  2 a .

Характерные геометрические параметры модели h, a, b выбирались много меньшими по сравнению с внутренним радиусом МП r 0 . Рассчитывалось распределение электрического потенциала φ ( x , z ) c граничными условиями , представленными на рис. 2, и электрическое поле Е ( x , z ) в зависимости от положения МП без учета влияния дзета-потенциала [7]. Влиянием дзета-потенциала можно пренебречь, если его величина мала по сравнению с напряжением смещения V 0 , а длина, на которой он спадает, много меньше ширины зазора.

Ионный ток I , протекающий через внутреннюю полость МП, рассчитывался путем интегрирования плотности тока j = σ E в рамках используемой

Рис. 3. Результаты моделирования работы СМИП при r 0 = 100 нм, V 0 = 0.2 В для образца в виде плоской диэлектрической поверхности со ступенькой высотой h= 1000 нм.

а — распределение потенциала φ ( x , z ); б — зависимость Δ I / I при z ₀ = 100 нм для различных толщин стенок d= 50, 100, 400 нм; в — зависимость z ( x ) при d = 100 нм для различных начальных зазоров z ₀ = 50, 100, 150 нм; г — зависимость z ( x ) при z 0 = 100 нм для различных толщин стенок d = 50, 100, 400 нм

модели (рис. 2). Проводимость σ определялась из справочных данных через известную концентрацию NaCl в водном растворе. В точке x 0 = а/ 2 устанавливался начальный зазор z 0 между поверхностью образца и торцом МП и вычислялся ток I 0 ( x 0 , z 0 ) . Затем МП перемещалась с шагом 2 r 0 вдоль координаты x вправо до точки x = 3/2 a , и на каждом шаге вычислялся зазор z ( x ), при котором значение тока оставалось постоянным I ( x , z ) = I 0 ( x 0 , z 0 ) = const .

Как и в [5], расчеты проводились с помощью метода конечных элементов в программном пакете COMSOL MULTIPHYSICS 3.5a с использованием модуля Electromagnetics/Conductive media DC [8].

При сканировании по координате x СМИП-изображение формируется за счет смещения сканера при замкнутой петле обратной связи СС, в результате которого поддерживается постоянное значение ионного тока (рис. 1). Будем считать ошибку слежения бесконечно малой, что справедливо для медленного сканирования. Тогда СМИП-изображением будет зависимость zI (x) = z(x) – – z0 (x=a/2), представляющая собой зависимость z(x) при I=const, сдвинутую на величину начального зазора. Будем в дальнейшем для простоты называть СМИП-изображением зависимость z(x).

Ионной ток рассчитывался при напряжении смещения V 0 = 0.2 В на внешнем электроде относительно заземленного внутреннего электрода, концентрации электролита n = 0.1 M, угле сходимости МП а = 7.5 ° . Радиус МП r 0 выбирался равным 100 нм. Расчеты выполнялись при различных начальных зазорах между поверхностью образца и торцом МП ( z 0 = 0.5 r 0 , 1.0 r 0 и 1.5 r 0 ) и различных толщинах стенки МП ( d = 0.5 r 0 , 1.0 r 0 и 4 r 0 ).

На рис. 3 представлены результаты моделирования. На рис. 3, а, дано для примера распределение потенциала φ ( z , x ) при расположении МП над краем ступеньки. Расположение МП по координате z выбрано таким образом, чтобы протекающий через нее ток I был равен току, соответствующему ее расположению в точке x = a/ 2, z 0 = r 0 . На рис. 3, б, показано относительное изменение тока при перемещении МП от точки x = a/ 2 до точки x = 3/2 a при начальном зазоре z ₀ = 100 нм для разных толщин стенок МП d = 50, 100 и 400 нм. На рис. 3, в, дано СМИП-изображение, рассчитанное для МП с толщиной стенки d = 100 нм при разных начальных зазорах z 0 = 50, 100 и 150 нм. На рис. 3, г, дано СМИП-изображение, рассчитанное для МП с толщиной стенки d = 100 нм, начальном зазоре z 0 = 100 нм при разных толщинах стенок МП d = 50, 100 и 400 нм.

Расчет показывает, что электрическое поля концентрируется по внешнему и внутреннему периметру на торце МП и в области около острого края ступеньки (рис. 3, а).

На рис. 3, б, видно, что наибольшее изменение тока (~20 %) при прохождении МП над ступенькой на поверхности наблюдается в случае толстой стенки ( d= 400 нм). Однако при этом наблюдается максимальное колебание тока при прохождении МП над ступенькой. Из рис. 3, в, следует, что наибольший контраст на СМИП-изображении наблюдается при начальном зазоре z ₀ = 50 нм. Однако при этом имеет место касание и вдавливание МП в поверхность образца, что приведет к ее разрушению. Таким образом, расчеты показывают, что существует оптимальный начальный зазор z ₀ = 100 нм, дающий максимальный контраст СМИП-изобра-жения без разрушения МП. Из рис. 3, г, следует, что при начальном зазоре z 0 = 100 нм наилучший контраст на СМИП-изображении дает МП с толстой стенкой d= 400 нм. Однако в этом случае на СМИП-изображении наблюдается гофрировка, отсутствующая в рассматриваемой модели вертикальной ступеньки. Размытие положения вертикальной стенки при этом составляет ~ 600 нм. Для МП с тонкой стенкой расчет дает меньшее размытие, но и меньший контраст на СМИП-изобра-жении. Из рис. 3, г, следует, что в рамках рассмотренной модели наименьшее размытие СМИП-изображения вертикальной стенки (~ 200 нм) при максимальном контрасте и отсутствии артефактов достигается при начальном зазоре z ₀ = 100 нм и толщине стенки МП d= 100 нм.

Таким образом, в случае высокой ступеньки ( h >> r 0 ) размытие положения ее вертикальной стенки при оптимальных значениях z 0 и d составляет ~ 2.0 r 0 , т. е. определяется диаметром внутреннего канала МП.

УСТОЙЧИВОСТЬ ЗОНДА-МИКРОПИПЕТКИ ПРИ РАБОТЕ В СИЛОВОМ РЕЖИМЕ

При использовании МП в качестве зонда в режиме силовой микроскопии необходимо оценить устойчивость такого зонда при продольном сжатии. Будем рассматривать МП как балку переменного сечения с внутренней полостью, зажатую с двух концов. Уравнение, описывающее изгиб балки переменного сечения, согласно [9], имеет вид

E d 2 ₂ d z

V

I (z)^ ^

+ F d" = 0,

где ξ — поперечное смещение оси балки; z — продольная координата; E — модуль Юнга материала балки; F — продольная сила, сжимающая балку; I ( z ) — момент инерции поперечного сечения балки. Для балки, опертой по концам, граничные условия к уравнению (2) имеют вид

_d2 _ξ

^ z = ^0, L    0,       2 2

= 0, z=0, L

где L — длина балки.

В случае балки, представляющей собой коническую трубу кругового сечения с внешним ра-

диусом R ( z ) = r₀ + ( R ₀

—

r ₀

)

z

L

и внутренним радиу-

сом r ( z ) = y R ( z ) имеем

Рис. 4. Модель зонда-микропипетки, используемая при расчете критической силы сжатия

I(z) = П [R4 (z) - r4 (z)] = П (1 - Y4) R4 (z), где R(z) — радиус стержня в зависимости от продольной координаты z; r0 и R0 — радиус стержня при z=0 и L соответственно (рис. 4); γ — постоянная, равная отношению внутреннего радиуса микропипетки r(z) к ее внешнему радиусу R(z).

Решив это уравнение, получим выражение для критической сжимающей силы F кр , выше которой стержень теряет устойчивость и изгибается:

n ³ E ( 1 - Y ⁴ ) r R 0

кр         4 L

.

Рассмотрим характерный для эксперимента случай L >>  R 0 и r 0 =d , или γ = 0.5.

Тогда tg a =

0.5 R о — Г, L

0.5 R ₀ L

Критическую силу (4) теперь можно предста- вить в виде

F KP = 64 ^n3Er o ²tg^{2 a} .                ⁽⁵⁾

Видно, что при острых углах заточки устойчивость зонда-микропипетки квадратично убывает с уменьшением r ₀ и α . Подставляя r ₀ = 200 нм и α = 7.5°, получим величину критической силы потери устойчивости F кр ~ 10^–5 Н. Поскольку характерные силы взаимодействия зонда с поверхностью образца в СЗМ имеют величину 10^–9–10^–7 Н, можно сделать вывод о возможности применения СМИП-зонда в режиме силовых измерений.

ЗОНДОВЫЙ ДАТЧИК ДЛЯ РАБОТЫ В ПОЛУКОНТАКТНОМ СИЛОВОМ И СМИП-РЕЖИМАХ

Как известно, обычно в качестве датчиков для измерения локальных сил в СЗМ используют кремниевые кантилеверы [2]. Совместить такой датчик, имеющий малые размеры и малый вес по сравнению с МП, не представляется возможным. Поэтому в основу зондового датчика функционирующего как в режиме измерения ионных токов, так и локальных сил была положена конструкция пьезорезонансного силового датчика [10–12]. Пьезокерамическая трубка 1 (рис. 5) длиной L = 5– 10 мм, диаметром D = 1.0–1.5 мм и с толщиной стенки H = 0.20–0.30 мм жестко закреплена с одного конца на плате 2.

Рис. 5. СМИП-датчик для измерения локальных ионных токов и локального силового взаимодействия.

1 — пьезокерамическая трубка; 2 — плата; 3 — капля скрепляющего клея; 4 — стеклянная МП; 5 — Ag/AgCl-электрод

Рис. 6. РЭМ-изображение профиля микропипетки (а) и ее торца (б)

На внутреннюю поверхность трубки нанесен проводящий электрод. На внешнюю поверхность трубки нанесены два электрически изолированных полуцилиндрических электрода. Одна часть трубки при прикладывании к ней переменного напряжения работает как пьезовибратор. Напряжение, снимаемое при этом со второй части трубки пропорционально амплитуде возникающих механических колебаний. К свободному концу трубки с помощью капли клея 3 прикреплена стеклянная МП 4. Сверху во внутреннюю полость МП вводится Ag/AgCl-электрод 5 в виде тонкой Ag проволоки, покрытой слоем AgCl. Заполнение внутреннего объема МП раствором электролита осуществляется под действием капиллярных сил.

Для создания МП использовались стеклянные капилляры из боросиликатного стекла с внутренним диаметром 0.5 мм и внешним диаметром 1 мм (Sutter Instrument, Novato, CA). Вытяжка капилля- ров проводилась на установке PMP 107 Micropipette puller. Радиус r0 внутренней полости МП лежал в диапазоне (100–500) нм. На рис. 6 представлены изображения МП, полученные в растровом электронном микроскопе (РЭМ).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Эксперименты проводилось в СЗМ ″NanoEducator″ [12]. Стандартный пьезорезонансный силовой датчик СЗМ ″NanoEducator″ с W-острием заменялся на СМИП-датчик (рис. 5). Образец размещался на дне стеклянной или пластмассовой чашки, закрепленной на сканере. В чашку заливался раствор электролита и устанавливался внешний Ag/AgCl электрод.

Рис. 7. Тестирование зонда-микропипетки.

а — резонансная кривая датчика с зондом-микропипеткой; б — вольт-амперная характеристика МП, измеренная вдали от поверхности образца ( z >> r 0 ); в — зависимость амплитуды колебаний зонда от равновесного расстояния до поверхности образца (кривая подвода); г — зависимость ионного тока через МП от расстояния до поверхности образца; д — изображение поверхности тестового образца, полученное в полуконтактном силовом режиме; е — СМИП-изображение тестового образца

X, мкм

На рис. 7 представлены результаты экспериментального исследования СМИП-датчика в полу-контактном силовом режиме и в режиме измерения ионных токов. В экспериментах использовался тестовый образец в виде отпечатка упорядоченных каналов на поверхности эпоксидного клея. Ширина каналов равнялась 5 мкм, глубина 1 мкм. Измерения проводились в 1 М растворе NaCl.

Из рис. 7, а, следует, что резонансная частота СМИП-датчика равна 6.2 кГц при добротности Q =25.4. Измерения, выполненные для разных датчиков, показали, что резонансные частоты датчиков изменялись в диапазоне (4.9–7) кГц при добротности Q = (20.6–26.0). На рис. 7, б, представлена зависимость I ( V ), измеренная вдали от поверхности образца z >>  r 0 . Наблюдаемая линейная зависимость I ( V ) согласуется с теоретическим выражением (1) и соответствует сопротивлению МП 10 МОм. Подставляя а =1.76 См/м и а =7.5 ° , получим r 0 = 220 нм, что по порядку величины согласуется с результатами, полученными при прямых измерениях размера внутренней полости МП (рис. 6, б). На рис. 7, в, г, представлены типичные кривые подвода в силовом и ионном режимах измерения, т. е. зависимости амплитуды колебаний пьезотрубки и ионного тока от ширины зазора между торцом МП и поверхностью образца. Следует отметить, что вид экспериментальной зависимости ионного тока от расстояния до поверхности образца (рис. 7, г) совпадал с видом теоретических кривых, рассчитанных с помощью метода конечных элементов. На рис. 7, д, е, представлены изображения тестового образца в виде отпечатка упорядоченных каналов на поверхности эпоксидного клея, полученные в полуконтактном силовом ( А =0.9 А max ) и СМИП ( I =15 нА, V =0.09 В)

режимах соответственно. Видно, что предложенный зондовый датчик дает адекватные результаты при визуализации диэлектрической поверхности как в режиме полуконтактной силовой микроскопии, так и в режиме микроскопии токов ионной проводимости.

Для улучшения пространственного разрешения при работе зонда-микропипетки в силовой моде на торце исходной МП (рис. 8, а) с помощью технологии фокусированного ионного пучка (ФИП) [13] формировался нановыступ (рис. 8, б). Использовался пучок ионов Ga при ускоряющем напряжении 30 кВ и токе пучка 300 пА. На рис. 9 представлены СЗМ-изображения тестовой решетки TGT [14] в виде регулярно расположенных Si-острий и их поперечные сечения, полученные в полуконтактной силовой моде с использованием МП с плоской вершиной с внешним диаметром торца ~3.5 мкм (рис. 9, а, б) и МП с нановыступом на торце, сформированным с помощью технологии ФИП (рис. 9, в, г). Сравнение изображений, представленных на рис. 9, а и в, а также их поперечных сечений на рис. 9, б и г, показывает, что МП с нановыступом (рис. 8, б) дает более высокое пространственное разрешение в полуконтактном силовом режиме. Вместе с тем пространственное разрешение, наблюдаемое на рис. 9, а, б, значительно лучше того, которого можно было бы ожидать от применения зонда-микропипетки с внешним диаметром ~ 3.5 мкм (рис. 8, а). Данный экспериментальный факт можно связать с присутствием на торце МП острого выступа, случайно образовавшегося в процессе ее вытяжки, либо с отклонением оси МП от нормали к поверхности образца.

Рис. 8. Электронно-микроскопические изображения.

а — исходный торец МП; б — торец МП с нановыступом, сформированным с помощью технологии ФИП

б

Рис. 9. СЗМ-изображения тестовой решетки TGT и их поперечные сечения, полученные в полуконтактной силовой моде.

а, б — зонд в виде микропипетки после вытяжки; в, г — зонд в виде микропипетки с нановыступом после модификации ФИП

Действительно, наклон оси МП может привести к тому, что с поверхностью образца будет взаимодействовать не вся плоскость торца МП, а только небольшой участок ее острого внешнего края. Следует учесть, что если нановыступ на торце МП будет иметь слишком большую длину, то, улучшая пространственное разрешение в силовом режиме, он будет осложнять работу в СМИП-режиме, не позволяя вплотную приблизиться поверхности образца к торцу МП. Вместе с тем из приведенного выше моделирования СМИП-изображения (рис. 3) следует, что рабочий зазор между поверхностью образца и торцом МП имеет величину ~ r0. Таким образом, если длина нановыступа будет соизмерима с радиусом r0, то такая МП будет работать как в режиме СМИП, так и давать высокое пространственное разрешение в силовом режиме.

Следует отметить, что в наших экспериментах зондовый датчик с МП стабильно работал в силовом режиме, но демонстрировал неустойчивую работу в режиме СМИП. СМИП-изображения часто срывались и случайным образом пропадали в процессе сканирования. Нестабильность СМИП-режима мы связываем с перекрытием внутреннего канала МП загрязнениями либо, наоборот, с появ- лением сети дополнительных каналов в тонких стенках МП вследствие известного явления выщелачивания боросиликатного стекла.

ВЫВОДЫ

Замена W-острия в пьезорезонансном СЗМ-датчике [10] на стеклянную МП с радиусом внутреннего отверстия r 0 ~ 100–500 нм и толщиной стенки d ~ 100–200 нм обеспечивает возможность создания СМИП, функционирующего также и в режиме силового микроскопа. Выполненные модельные расчеты указывают на существование оптимального начального зазора между поверхностью образца и торцом МП и оптимальной толщины стенки МП, при которых достигаются наилучший контраст и пространственное разрешение на СМИП-изображении. Датчик с МП в качестве острия демонстрирует устойчивую работу как в воздушной, так и в жидкой среде. При погружении кончика МП в жидкость резонансная частота датчика имеет величину f ~ 6 кГц, а добротность Q ~ 20, что обеспечивает визуализацию поверхности диэлектрического образца, погруженного в раствор электролита, как в СМИП-режиме, так и в полуконтактном силовом режиме, Нановыступ на торце МП, созданный с помощью технологии ФИП, улучшает пространственное разрешение в силовом режиме. Нановыступ на торце МП не будет влиять на работу зонда в СМИП-режиме, если его длина не будет превышать длину внутреннего радиуса МП. Для стабильной работы датчика в СМИП-режиме необходимо обеспечить чистые условия эксперимента, исключающие загрязнение внутреннего канала МП, и использовать кварцевые капилляры, для исключения выщелачивания их тонких стенок в растворе электролита.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009–2013 гг. (ГК П557) и гранта НИУ ИТМО "Исследование электромагнитных и электронных свойств наноструктур на основе нановиске-ров".