Скрининговый анализ мутаций в 9 экзоне гена CALRС использованием метода гетеродуплексного анализа

Введение. На сегодняшний день идентифицировано и классифицировано более 50 различных мутаций в гене CALR , ассоциированных с хроническими миелопролиферативными новообразованиями (ХМН). Все мутации делят на два типа, к первому типу относятся делеции ко второму типу — инсерции. Мутации типа 1 чаще встречаются при миелофиброзе (МФ), тогда как при эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) мутации типа 1 и типа 2 встречаются с одинаковой частотой. Случаи наличия CALR мутаций при истинной полицетемии (ИП) в литературе имеются,но остается неясным клиническое значение таких мутаций и их вклад в развитие патогенеза ИП.

Для выявления всех возможных вариантов CALR мутаций удобнее использовать методы секвенирования. Вместе с тем,высокая стоимость секвенирования определяет необходимость разработки двухэтапного алгоритма тестирования с предварительным использованием более доступного скринингового теста. Ранее мы предложили двухэтапный алгоритм для обнаружения мутаций в экзоне 12 JAK2 с использованием недорогого скринингового теста с помощью гетеродуплексного анализа.

Цель. Продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) для выявления мутаций в 9 экзоне гена CALR в качестве предварительного скринингового теста.

Материалы и методы. В исследование было включено 6образцов ДНК пациентов с различными фенотипическими формами ХМН и различным уровнем аллельной нагрузки мутациями в гене CALR. Было получено письменное информированное согласие пациентов на прове- дение научного исследования. Наличие мутаций в гене CALR в выбранных образцах ДНК было ранее определено методом секвенирования по Сэнгеру (АВ3500, США). Для определения уровня аллельной нагрузки образцы ДНК также были проанализированы методом пиросеквенирования (PyroMark Q24, Германия). Для отработки скринингового теста проводили ПЦР с дополнительным этапом образования гетеродуплексов с использованием набора реагентов «ПЦР-комплект» (Синтол, Москва) на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США). ПЦР-продукты детектировали методом электрофореза в 8 % ПААГ.

Результаты. Диагнозы ЭТ и МФ для шести выбранных пациентов ранее подтверждены морфологическим исследованием трепано-биоптата костного мозга. Важно отметить что у одного из шести пациентов был подтвержденный диагноз ИП,что является редким явлением. Все шесть пациентов имеют шесть различных indel вариантов мутаций в 9 экзоне CALR , в частности, пациент № 1 имеет мутацию с. 1154_1155insGTGTC; № 2 — с. 1128_1129insCTTTGCTT и c. 1131_1133delAGA; № 3 — с. 1100_1151del (52); № 4 — c.1154_1155insTTGTC; № 5 — с. 1092_1143del (51); № 6 — c.1154_1155insTTGTC. Минимальное и максимальное количество нуклеотидов отличающих мутантную последовательность 9 экзона CALR от дикого типа, при разных вариантах мутаций составило 5 и 52, соответственно. Уровень аллельной нагрузки варьировал в выбранных образцах ДНК от 25 % до 50 %.

При анализе полученных электрофореграмм на дорожках всех шести проб, имеющих мутации, чётко визуализируется основной фрагмент соответствующий дикому типу — 265 п. о. Полосы, соответствующие мутантным аллелям

ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XV, № 2, 2019

визуализируются лишь для пациентов № 3 и № 5, имеющих крупные делеции. На дорожках пациентов № 1, № 2, № 4 и № 6 таковые полосы отсутствуют, что, по-видимому, обусловлено типом мутации, то есть, во всех этих четырех вариантах мутантный аллель отличается от аллеля дикого типа инсерцией 5-ти нуклеотидов. Важно отметить, что во всех шести случаях также визуализируются дополнительные полосы выше фрагмента дикого типа,соответ-ствующие гетеродуплексам, образованным сочетанием фрагментов дикого и мутантного типов аллелей. Таким образом, использование метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволило выявить мутации в 9 экзоне гена CALR во всех выбранных образцах ДНК.

Выводы . Предлагаемый вариант гетероду-плексного анализа с детекцией в ПААГ может быть рекомендован к использованию как скрининговый тест, предшествующий секвенированию. Двухэтапный подход позволяет оптимизировать алгоритм и повысить эффективность тестирования пациентов с подозрением на мутации в 9 экзоне гена CALR .