Случаи диффузной В-крупноклеточной лимфомы с функционально значимыми интронными мутациями в гене ТР53

Несмотря на всю сложность генетических изменений, происходящих в геноме злокачественной клетки, мутации гена ТР53 являются наиболее частым, универсальным нарушением, обнаруживаемым при широком круге злокачественных новообразований. Являясь драйвером опухолевого процесса, они служат не только маркером агрессивного течения опухоли, но и независимым предиктором снижения чувствительности к лечению [1] .

Частота и спектр мутаций в гене ТР53 описаны при диффузной В-крупноклеточной лимфоме (ДВККЛ) на небольших выборках пациентов [2, 3]. Однако в центре внимания исследователей, как правило, были мутации в 5–8 экзонах гена, кодирующих ДНК-связывающий домен белка. Интронные мутации ТР53 долгие годы не входили в круг интересов исследователей. Например, в Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer, The TP53 UMD mutation database in human cancer (2017 release) и IARC TP53 mutation Database (2012 release) перечислены только аберрации в кодирующих последовательностях гена ТР53 [4–6]. Лишь небольшое число интронных мутаций гена ТР53 аннотировано в Human Gene Mutation Database [7].

Наличие в гене ТР53 функционально значимых интронных изменений было продемонстрировано в экспериментах in vitro и на выборках больных отдельными вариантами неходжкинских лимфом [8, 9]. В частности, описаны интронные мутации, которые в результате альтернативного сплайсинга приводят к генерированию изоформ белка р53, отсутствующих в норме. Для данных изоформ характерны не только утрата транскрипционной активности и канонических функций опухолевого супрессора, но и появление способности придавать несущим их клеткам высокий метастатический потенциал [10].

До настоящего времени при изучении ТР53 в опухолевой ткани больных ДВККЛ исследования были сосредоточены на поиске мутаций в 5–8 экзонах гена [1, 2], поэтому требуются дальнейшие исследования спектра изменений в интронных последовательностях гена ТР53 и определения их функционального эффекта при ДВККЛ.

В статье описаны 2 клинических наблюдения ДВККЛ, которые представляют интерес как впервые публикуемые в российской научной литературе случаи выявления функционально значимых интронных мутаций ТР53 в опухолевой ткани лимфомы.

Клиническое наблюдение 1

Пациент Ч., 73 лет, поступил в гематологическое отделение Городского гематологического центра г. Новосибирска с жалобами на боли в десне, лихорадку до 38,5 ºС в вечернее время суток, трудности при пережевывании пищи, потливость по ночам, повышенную утомляемость.

Считает себя больным в течение 2 мес, когда отметил боль в 6 верхнем зубе слева, отек щеки и десны. После удаления зуба сохранялся отек тканей. При рентгенографии костей черепа выявлено образование верхней челюсти слева, выполнена биопсия. При иммуногистохимическом исследовании верифицирована ДВККЛ CD20+, неспецифицированная. По данным мультиспираль-ной компьютерной томографии лицевого скелета выявлено объемное образование левой гайморовой пазухи размером 23,8×22×19,5 мм, вызывающее деструкцию нижней и латеральной стенок пазухи, а также альвеолярного отростка верхней челюсти, распространяющееся на жировую клетчатку шеи и ротовую полость.

При дообследовании: ЛДГ – 708 МЕ/л, Фг – 5,7 г/л, СОЭ – 38 мм/ч. По данным трепанобиопсии: специфическое поражение костного мозга.

Поставлен диагноз: ДВККЛ CD20+, неспеци-фицированная, IVE стадии с поражением левой гайморовой пазухи, альвеолярного отростка верхней челюсти, жировой клетчатки шеи и ротовой полости, костного мозга, впервые выявленная; группа высокого риска по Международному прогностическому индексу (МПИ).

В связи с возрастом и соматической отягощен-ностью рекомендованы курсы по протоколу R-СОР (ритуксимаб, циклофосфан, винкристин и преднизолон). После 2 курсов терапии отмечено уменьшение объема образования, нормализация носового дыхания. После 6 курсов терапии констатирована ремиссия, проводилось введение Ритуксимаба 1 раз в 3 мес. Однако спустя полгода пациент отметил увеличение правого яичка, консультирован онкоурологом, выполнена орхэктомия справа. По данным гистологического и иммуногистохимического исследований верифицирована ДВККЛ CD20+, неспецифицированная. По данным КТ в малом тазу выявлено мягкотканное образование 12×10×6,6 см. Диагностирована ДВККЛ CD20+, неспецифицированная, IVE стадии с поражением левой гайморовой пазухи, альвеолярного отростка верхней челюсти, жировой клетчатки шеи и ротовой полости, костного мозга, первая ремиссия; I ранний рецидив IVE стадии с поражением правого яичка, лимфоузлов малого таза, индукция ремиссии; группа высокого риска по МПИ. Проведено 6 курсов полихимиотерапии, после второго по протоколу R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфан, винкристин, доксорубицин и преднизолон) констатирована резистентность к лечению, направлен на высокодозную химиотерапию. На очередной курс терапии пациент не явился в связи с летальным исходом от прогрессирования заболевания.

В ходе прямого секвенирования по Сенгеру в опухолевой ткани ДВККЛ выявлены изменения в гене ТР53: сеймсенс мутация p.L252L в кодирующей последовательности; мутация в 6 интроне IVS6-36G>C (рис. 1).

Данный клинический случай ДВККЛ характеризовался экстранодальным опухолевым по- ражением в дебюте заболевания, выраженными симптомами опухолевой интоксикации, высокой параклинической активностью опухоли, развитием раннего рецидива гемобластоза с экстранодальным очагом поражения в забарьерной ткани, резистентным к лечению.

Выявленная у пациента при секвенировании интронная мутация IVS6-36G>C имеет доказанную биологическую значимость. В экспериментах in vitro было показано, что IVS6-36G>C в отсутствие изменений в кодирующей последовательности гена приводит к выживанию клеток в условиях химиотерапии и длительно ингибирует апоптоз [11]. Согласно данным литературы, она связана с семейными формами рака молочной железы, риском возникновения рака простаты и предрасположенностью к раку щитовидной железы у детей [11, 12].

Мутация расположена в 6 интроне гена ТР53 и, согласно данным The Human Cancer Mutation Database, относится к изменениям, влияющим на сплайсинг [7]. Хотя замена IVS6-36G>C расположена далеко от экзон/интронного стыка, где обычно находятся сайты сплайсинга, описаны другие механизмы влияния изменения нуклеотидной последовательности в некодирующих регионах на созревание молекулы мРНК. В частности, мутации в интронах способны генерировать новые сайты сплайсинга, которые, конкурируя с исходными сайтами, замедляют сплайсинг мРНК. В ряде случаев такой новый сайт может распознаваться системой процессинга РНК как аутентичный сайт сплайсинга, тогда в процессированную мРНК включается часть интрона. Это приводит к сдвигу рамки считывания и образованию укороченного белка.

Клиническое наблюдение 2

Пациент Г., 46 лет, поступил в гематологическое отделение Городского гематологического центра г. Новосибирска c жалобами на слабость, температуру в вечернее время до 38 ºС, ночную профузную потливость, потерю веса на 9 кг за 12 мес, увеличение всех групп периферических лимфоузлов.

Рис. 1. Результаты секвенирования: А – мутация p.L252L, В – интронная мутация IVS6-36G>C

Fig. 1. Sequencing results: A – p.L252L mutation, B intron mutation of IVS6-36G>C

Считает себя больным в течение полугода, когда впервые обнаружил безболезненное увеличение надключичного лимфоузела справа до 0,5 см. Консультирован ЛОР-врачом – без патологии, инфекционистом – выявлен хронический вирусный гепатит С минимальной степени активности. После консультации онколога проведена операционная биопсия увеличенного лимфоузла. По данным гистологического и иммуногистохимического исследования верифицирована диффузная В-крупноклеточная неспецифицированная лимфома СД20+; уровень экспрессии маркера Ki67 опухолевыми клетками 35 %, BCL6-, СД10-. Направлен к гематологу.

Объективно: состояние средней степени тяжести, пальпируются все группы периферических лимфоузлов, плотные, безболезненные, шейные лимфоузлы справа – массивное поражение. Селезенка на 5 см ниже реберной дуги. По данным дообследования: УЗИ органов брюшной полости – выраженная спленомегалия (площадь селезенки – 78 см2); КТ органов грудной клетки – лимфоузлы в средостении увеличены до 3–4 см; в биохимическом анализе крови: Фг – 4,4 г/л, ЛДГ – 741 МЕ/л, ЩФ – 456 Е/л, Тп – 6 Ед, СРБ – 24 Ед.; в ОАК – СОЭ 25 мм/ч. В трепанобиоптате скопления крупноклеточных опухолевых элементов.

На основании жалоб, анамнеза, объективного осмотра, данных лабораторно-инструментального обследования был выставлен диагноз: диффузная В-крупноклеточная, неспецифицированная СД20+ лимфома IVS стадии с поражением всех групп периферических лимфоузлов, лимфоузлов средостения, селезенки, костного мозга, впервые выявленная. Группа промежуточного/высокого риска по МПИ.

Получил 6 курсов полихимиотерапии по протоколу R-СНОР с положительной динамикой в виде уменьшения объема опухоли, однако в августе 2011 г. в межкурсовой промежуток отметил интенсивные боли в эпигастрии. По данным обследования имеются признаки прогрессирования заболевания: увеличение абдоминальных лимфоузлов, лимфоузлов малого таза до массивных, выраженная спленомегалия (объем селезенки 452 мл), появление очагов поражения в костях – позвонках L2, L4, L5, S1, костях таза, поражение стенки мочевого пузыря, плевры с двух сторон. Экстренно госпитализирован в отделение с выраженным болевым синдромом.

По жизненным показаниям проведена терапия по протоколу высокодозной химиотерапии DHAP (цисплатин, цитозар, дексаметазон), которую перенес удовлетворительно. Однако в межкурсовой период пациент скончался от прогрессирования гемобластоза.

В ходе прямого секвенирования по Сенгеру в опухолевой ткани ДВККЛ были выявлены следующие изменения в гене ТР53: миссенс мутация p.T155I, мутация сдвига рамки считывания p.A189Pfs и интронная мутация IVS5+43G>T (рис. 2). Все мутации были в гомозиготном состоянии, что свидетельствовало о потере гетерозиготности в гене ТР53 в опухолевой ткани ДВККЛ у данного пациента.

Описанный клинический случай ДВККЛ характеризовался исходно массивным опухолевым поражением, быстропрогрессирующим течением заболевания, выраженными симптомами опухолевой интоксикации, высокой параклинической активностью опухоли и плохим ответом на терапию с последующей генерализацией лимфомы.

Рис. 2. Результаты секвенирования: А – мутация p.T155I, В – мутация p.A189Pfs, С – интронная мутация IVS5+43G>T, D – интронная мутация IVS4-30Т>С

Fig. 2. Sequencing results:

A – p.T155I mutation, B p.A189Pfs mutation, С – intron mutation of IVS5+43G>T, D – intron mutation of IVS4-30Т>С

В ходе секвенирования, помимо патогенной миссенс-мутации p.T155I и мутации сдвига рамки считывания p.A189Pfs, приводящей к синтезу укороченного неактивного белка р53, в опухолевом материале было выявлено две интронные мутации, не фиксированные в специализированных базах данных.

В базе данных dbSNP в позиции IVS5+43 описана другая однонуклеотидная замена G>С (rs765032410, NC_000017.11:g.7675010C>G), однако ни популяционная частота редкого аллеля (Minor allele frequency – MAF), ни клиническое значение rs765032410 не известны [13]. Однако согласно прогнозу NetGene2 [14], IVS5+43G>Т приводит к образованию дополнительного акцепторного сайта сплайсинга, который отсутствует в норме, что может приводить к включению в последовательность м-РНК части 5 интрона, преждевременному образованию стоп-кодона в 189 положении и синтезу укороченного варианта белка р53, лишенного функциональной активности. Отдельно также следует отметить IVS4-30Т>С ввиду того, что в 4 интроне ТР53 расположен альтернативный промотор гена, участвующий в синтезе изоформы delta133, которая в норме экспрессируется в лимфоидной ткани [15]. Однако на данный момент оценить ее влияние на транскрипцию гена не представляется возможным.

Таким образом, результаты молекулярногенетического анализа свидетельствуют о наличии в опухолевой ткани ДВККЛ у данного пациента множественных функционально значимых мутаций ТР53, в том числе интронных, сочетающихся с потерей нормального аллеля гена.

Заключение

В литературе описаны интронные мутации в гене ТР53 , которые приводят к генерированию в результате альтернативного сплайсинга отсутствующих в норме изоформ белка р53. Для данных изоформ характерны не только утрата