Содержание факторов роста тромбоцитов в плазме и их влияние на диплоидные фибробласты в культуре

Обогащенная тромбоцитами плазма нашла применение в клинической практике: стоматологии, травматологии, хирургии, спортивной медицине, косметологии с целью улучшения регенерации ткани [1-5]. Использование такой плазмы основано на свойствах тромбоцитов, в которых обнаружены специализированные секреторные бета- и альфа-гранулы. В бета-гранулах находятся низкомолекулярные соединения (АТФ, АДФ, серотонин, ионы кальция и магния, ГДФ, ГТФ и некоторые другие), регулирующие, прежде всего, сосудистые реакции и агрегацию тромбоцитов. Альфа-гранулы содержат белковые соединения (бета-тромбоглобулин, фактор 4 тромбоцитов, фактор V, фактор Виллебранда, фибриноген, тромбоспондин, фибронектин, витронектин, макроглобулин, Р-селектин, факторы роста тромбоцитов, ингибитор-1 активатора плазминогена, ингибитор плазмина, альфа 1-антитрипсин, протеин S, лейкоцитарный хемотаксический фактор, высокомолекулярный кини-ноген). С ними связано многостороннее участие белков альфа - гранул в физиологических и патологических процессах, а именно, митогенный и хемотаксический эффекты, адгезивное действие, модулирование агрегации тромбоцитов, участие в плазменном гемостазе, вазоактивное действие, иммунные эффекты [7, 8]. Для получения аутологичных факторов роста в основном применяется обогащенная тром- боцитами плазма (ОТФРА- обогащенная тромбоцитарными факторами роста аутоплазма). Нормальная концентрация тромбоцитов составляет в среднем 220000 клеток в 1 мкл. В ОТФРА концентрация тромбоцитов превышает нормальную в 3-

3,5 раза. Клинически эффективной до сих пор считают концентрацию тромбоцитов в ОТФРА приблизительно 4000% их уровня в периферической крови [9]. В таблице 1 представлены факторы роста тромбоцитов и их действие.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о большой вариабельности концентрации тромбоцитарных факторов роста [10]. При этом клиническая эффективность этих факторов продемонстрирована даже в меньшей концентрации [10, 11]. Интересным представляется исследование М.С. Макарова с соавт., посвященное изучению влияния плазмы с различным уровнем факторов роста на фибробласты - основные клетки, с которыми связана выработка белков кожи, в частности, коллагена. В указанной работе проводился сравнительный анализ уровней факторов роста в сыворотке и плазме крови с помощью набора реагентов Qantikine, HumanPDGFImmunoassay и системы «Multiskanascent» (Thermo). Показано, что концентрация тромбоцитарного фактора роста (PDGF) варьирировала от 0 до 2 pg/ml в плазме и от 90 до 390 pg/ml в сыворотке. Полученные различия связаны с тем, что в ходе получения плазмы тромбоциты оседают на дно пробирки без видимых повреждений исходной структуры, поэтому в плазме PDGF присутствует в небольших количествах. При получении сыворотки образование тромбофибрино-вого сгустка сопровождается массовым выбросом содержимого гранул тромбоцитов [12]. В других исследованиях обнаружено, что концентрация всех изоформ PDGF в сыворотке крови поддерживается на постоянном уровне и составляет 5060 нг/мл, но отсутствует в плазме, лишенной клеток [1]. В то же время следует сказать, что в доступной нам литературе данных о количестве тромбоцитарных факторов роста в обогащенной тромбоцитами плазме крайне недостаточно. Имеются сведения в рекламном проспекте MagellanPRP [13]. Исследование выполнялось с использованием ИФА ELISA. Анализы проводились с исходной кровью и с плазмой крови, обогащенной тромбоцитами. В работе G. Weibrich с соавт. представлены результаты исследования содержания факторов роста в обогащенной тромбоцитами плазме и их корреляции с полом и возрастом доноров, а также с содержанием тромбоцитов в плазме [14]. Важно, что в работе G. Weibrich с соавт. не обнаружено значимо достоверной корреляции между содержанием факторов роста и количеством тромбоцитов в цельной крови, в обогащенной тромбоцитами плазме. В наших исследованиях предложено использовать в клинических целях не обогащенную тромбоцитами плазму. В связи с этим целью данной работы явилось определение уровней факторов роста в плазме с нормальным количеством тромбоцитов и эффективность их воздействия на фибробласты.

Материалы и методы. Анализировались образцы плазмы крови 50 условно здоровых людей в возрасте 30-40 лет (22 мужчины и 28 женщин). Для получения плазмы кровь в количестве 8,5 мл забирали в вакуумные пробирки МеаPlasma, центрифугировали 10 минут при относительной силе центрифугирования 700-900 G. В процессе центрифугирования кровь разделялась сепарационным гелем на плазму с тромбоцитами и седимент (эритроциты, лейкоциты и т.д.). В пробирках МеаPlasma в качестве геля использовалось соединение, разработанное на основе кремния и углерода: такой гель обладает тиксотропными свойствами, устойчив к радиационной стерилизации, не смешивается с кровью, не оставляет примеси в плазме, содержащей тромбоциты. Антикоагулянтом явился фракционированный гепаринат натрия со средней молекулярной массой 4500 Дальтон (внесен в список USP и используется для производства препарата Enoxaparin, зарегистрированного в FDA). Выбор антикоагулянта связан с тем, что его получают из природного сырья, поэтому механизм его действия более физиологичен по сравнению с синтетическими веществами. Он имеет низкую молекулярную массу, что предотвращает формирование гепарин – индуцированной тромбоцитопении. Количество тромбоцитов измеряли на агрегометре Биола АЛТФ – 2 23OLA. Содержание тромбоцитарных факторов роста определяли методом ИФА на анализаторе Tecan Sunrise (Австрия) с использованием диагностических наборов Bio – Ocean LLC (USA). Исследование включало анализ количества следующих факторов роста: TGFбета 1, PDGF aa, VEGF и IGF. Для оценки воздействия плазмы с нормальным уровнем тромбоцитов на культуру клеток использовали культуру фибробластов дермы человека 6 пассажа. Культура была стерильна, микоплазмами и вирусами не контаминирована. Жизнеспособность клеток культуры сохранялась в 98%. Перед вводом в эксперимент клетки культуры были морфологически однородны, преимущественно веретеновидной, реже звездчатой формы, с четкими контурами, выраженными отростками, плотными овальными ядрами. Клетки засевались на 18 чашек Петри (Costar,

USA) с плотностью 15х103/см2. Культивирование проводили в СО2 – инкубаторе при t= 37oC, 5% CO2 и абсолютной влажности. Ростовая среда имела следующий состав: среда ДМЕМ с добавлением антибиотиков (пенициллин/стрептомицин), 2 % глутамина, 10% телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС). Все использованные реактивы и среды ООО «ПанЭко» Россия. Через 24 часа после пересева состояние культуры контролировали. Культура была представлена клетками веретеновидной формы, в виде монослоя распределенными по поверхности пластика. Клетки формировали межклеточные контакты. Среду из всех чашек отбирали и заменяли: в контрольных сериях на среду с 10% ТЭС, а в опытных на среду с 10% пула плазмы с тромбоцитами. Пул состоял из образцов плазмы тех добровольцев, в крови которых определяли уровни тромбоцитарных факторов роста. Дальнейший рост культуры проходил в СО2 инкубаторе при стандартных условиях. Через 24, 48 и 72 часа после начала взаимодействия с с плазмой контролировали состояние культуры. Визуализацию нативной культуры проводили с помощью инвертированного микроскопа «Leica DMI 3000B», оснащенного программой визуализации изображений LAZ. V. 3.4, и фиксировали в видеоархив. Использовали методы светлого поля и фазового контраста. Для оценки характера монослоя использовали увеличение 40х, а для исследования морфофункционального состояния клеток увеличение 100х, 200х. В эти же сроки каждые 24 часа клетки с поверхности пластика 3х контрольных и 3х опытных чашек снимали стандартным способом с помощью 0,25% раствора трипсина в растворе Версена (ООО ПанЭ-ко, Россия), отмывали раствором фосфатного буфера (PBS), центрифугировали и полученную суспензию окрашивали 4% раствором трипанового синего в течение 2-3 минут. За это время погибшие клетки с поврежденной мембраной успевают равномерно окраситься. Количество живых (не окрашенных) и погибших клеток подсчитывали в камере Горяева, в каждой серии использовали данные, полученные при подсчете не менее чем в четырех камерах.

Кроме того, подсчет концентрации и жизнеспособности дублировали с помощью счетчика клеток «Countess», Invitrogen, USA, иcпользуя краситель трипановый си-ний.Статистическая обработка результатов проводилась при помощи программного обеспечения Microsoft Office Exel 2007 и Statistica 10. Нормальность распределения данных проверялась с использованием критерия Шапиро-Уилка. Статистически значимые различия устанавливались с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Среднее содержание тромбоцитов в анализируемых пробах плазмы составляло 280000/мкл. Это свидетельствовало о том, что плазма не обогащена тромбоцитами, а содержит их нормальное количество. Уровни анализируемых тромбоцитарных факторов роста представлены отдельно для мужчин и женщин разного возраста в таблице 2.

Как известно, трансформирующий (тромбоцитарный) фактор роста TGF – бета 1 контролирует пролиферацию и клеточную дифференцировку, участвует в иммунном ответе, раке, развитии сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного диабета, синдрома Марфана, болезни Паркинсона и иммунодефицита. В наших исследованиях статистически значимых различий в уровнях TGF-β1 между мужчинами и женщинами разного возраста не выявлено, но результаты были в среднем статистически значимо выше по сравнению с референсными величинами.

Таблица 2. Уровни тромбоцитарных факторов роста в плазме, не обогащенной тромбо- цитами

- различия статистически значимые по сравнению с референсными значениями (p≤ 0,05)

Средние величины фактора роста PDGF-аа оказались повышенными у мужчин в среднем в 1,2 раза, у женщин – 1,5 раза по сравнению с референсными уровнями. PDGF-аа активирует пролиферацию эпидермальных и эпителиальных клеток, закрытие кожной раны, стимулирование ангиогенеза. В основном это связано со стимулированием выработки коллагена. Для проблем с кожной патологией такие изменения показателя PDGF должны представлять интерес. Фактор роста VEGF – сосудистый фактор эндотелиального роста, участвующий в стимуляции роста новых кровеносных сосудов. У всех обследуемых мужчин и женщин и индивидуальные и средние показатели оказались выше референсных значений в 4-5 раз (p≤ 0,05). Повышение уровней VEGF способствует росту новых сосудов, что оказывает благотворное влияние на обеспечение кислородом и питательными веществами кожи и улучшения ее состояния. Содержание эпидермального фактора роста - EGF оказалось, напротив, ниже референсных значений (p≤0,05). Известно, что EGF стимулирует клеточный рост и клеточную дифференцировку эпителиального покрова с помощью рецептора эпидермального фактора роста. Фактор роста IGF-1 инсулиноподобный фактор роста – соматоме-дин 1 – по структуре и функциям сходен с инсулином. Этот фактор участвует в эндокринной, аутокринной и паракринной регуляции процессов роста, развитии и дифференциации клеток и тканей организма. Кроме того известна его роль в пролиферации заживления ран или травм, стимулировании формирования межклеточного вещества. В наших исследованиях этот показатель статистически значимо не изменялся. Таким образом, не обогащенная тромбоцитами плазма, полученная новым способом, может быть эффективна за счет умеренного накопления в ней необходимых для роста и развития кожи факторов роста без риска получения осложнений в виде избыточного деления клеток.

На следующем этапе нашей работы анализировали эффект воздействия пула плазмы, содержащей нормальное количество тромбоцитов, на пролиферацию фибробластов дермы человека. Контролем были серии той же тестовой культуры фибробластов, которые культивировали в таких же условиях в среде с 10% телячьей эмбриональной сыворотки. На протяжении всего исследования клетки культуры во всех сериях были морфологически однородными, преимущественно веретеновидной, реже звездчатой формы с выражен- ными отростками. Ядра плотные, овальной формы, с двумя - четырьмя плотными ядрышками. Через 48 часов после начала взаимодействия с пулом плазмы в культуре наблюдали большое количество делящихся клеток, количество которых визуально преобладало в экспериментальных сериях. Количественный анализ показал равномерное увеличение содержания (плотности) клеток как в контрольных, так и в опытных сериях в процессе роста со значительным преобладанием в опытных сериях с добавлением пула плазмы (p≤0,05) (табл. 3). На всех сроках исследования жизнеспособность клеток составляла не менее 98-99%.

Таблица 3. Изменение плотности фибробластов дермы человека в процессе роста (кле-ток/см2)

- статистически значимые различия (p≤0,05)

Источником PDGF и TGF являются активированные тромбоциты. TGF – бета 1 контролирует пролиферацию и клеточную дифференцировку, PDGF является основным митогеном для фибробластов, клеток гладкой мускулатуры и других типов, тем самым играя важную роль в заживлении ран, поддержании состояния кожи. Следовательно, получение плазмы, содержащей повышенный уровень PDGF и ТGF, может иметь важное значение при использовании плазмы в дерматологии и косметологии. Повышение уровней VEGF способствует благотворное влияет на обеспечение кожи кислородом и питательными веществами и улучшения ее состояния. Таким образом, не обогащенная тромбоцитами плазма, полученная новым способом, может быть эффективна за счет умеренного накопления в ней важнейших для кожи тромбоцитарных факторов роста. Проведенное исследование на культуре фибробластов дермы человека продемонстрировало стимулирующее воздействие пула плазмы с нормальным содержанием тромбоцитов на пролиферацию этих клеток.

росту новых сосудов, что в свою очередь