Содержание металлотионеинов в органах овец при хроническом поступлении свинца с рационом

Свинец как загрязнитель окружающей среды и классический токсичный элемент привлекает внимание не только гигиенистов и токсикологов, но и экологов (1-4). В организм млекопитающих он поступает с кормом и водой и накапливается в органах и тканях. При изучении воздействия свинца на млекопитающих одним из информативных показателей служит количество металлотионеинов (МТ) в тканях органов (5-8).

МТ — это низкомолекулярные белки (6-7 кДа), содержащие до 30 % цистеина. В организме млекопитающих МТ связывают ионы тяжелых металлов (Cd2+, Zn2+, Pb2+, Hg2+, Cu2+), поддерживают гомеостаз меди и 839

цинка и действуют как ловушка для свободных радикалов (9-12). Ионы металлов по степени индукции синтеза МТ в печени мышей располагаются в последовательности Cd2+ > Pb2+ > Zn2+ > Hg2+ > Cu2+ (13).

На лабораторных животных показано, что при воздействии свинца активация синтеза МТ в тканях органов зависит от способа введения. Так, экспрессию МТ, связывающих свинец и цинк, в тканях органов мышей регистрировали при введении ацетата свинца внутривенно и внутрибрюшинно, но не подкожно (14). Повышение количества МТ в тканях почек у крыс отмечали при хроническом поступлении свинца с питьевой водой в концентрациях 200-300 мг/л (15).

На сельскохозяйственных животных, в частности овцах, установлено, что хроническое поступление нитрата свинца с рационом в дозах 5; 25 и 150 мг/кг корма приводит к увеличению содержания МТ в лимфоцитах периферической крови (16). В то же время данные о синтезе МТ в органах сельскохозяйственных животных при поступлении свинца с рационом отсутствуют. Более того, не установлены конститутивные уровни синтеза этих соединений у овец в органах с разными физиологическими функциями, которые различаются по интенсивности накопления свинца и пролиферации. Так, печень и почки имеют низкую пролиферативную активность и накапливают больше свинца по сравнению с селезенкой (17-21).

Предполагается, что содержание МТ в тканях органов у млекопитающих зависит не только от количества свинца, способа его введения, вида ткани и ее физиологических функций, но и от числа клеток в органе и их функциональной активности (интенсивность синтеза и экспрессия генов МТ). При хроническом воздействии свинца на млекопитающих изменение функциональной и синтетической активности клеток может сопровождаться снижением их жизнеспособности и(или) пролиферацией, что приводит к изменению индекса массы органа (отношение массы органа к живой массе животного).

В представляемом исследовании на овцах романовской породы мы впервые оценили уровень конститутивного синтеза МТ в органах с разной функцией и индуцированную экспрессию МТ в условиях хронической интоксикации свинцом, поступающим с рационом, при сопоставлении с состоянием и пролиферативной активностью в этих органах. Сравнительный анализ выявил различия в содержании МТ в органах. В целом рост токсической нагрузки сопровождался негативными процессами — снижением синтеза МТ при повышении числа клеток и увеличении относительной массы органов. Возможно, один из факторов высокой чувствительности спленоцитов к воздействию свинца — низкий уровень конститутивного синтеза МТ.

Целью настоящего исследования стала оценка содержания метал-лотионеинов, клеточности и индекса массы печени, почек и селезенки у овец при хроническом поступлении свинца с кормом.

Методика. Исследования проводили на 27 овцах романовской породы (живая масса 33,0±1,1 кг, возраст 1-1,5 года). Кормление и уход за животными осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 г. ¹ 708 н). Овец содержали в условиях вивария Всероссийского НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (г. Боровск, Калужская обл.), кормили дважды в сутки при свободном доступе к воде. Рацион включал 0,3 кг комбикорма и 2 кг разнотравного сена. Комбикорм содержал 44,0 % ячменя, 41,4 % пшеницы, 11,7 % подсолнечного шрота, 1,0 % поваренной соли, 1,0 % обесфторенного фосфата, 1,0 % премикса; состав сена — 87,9 % сырого вещества, 8,89 % протеина, 2,26 % жира, 32,6 % клетчатки, 4,26 % золы.

Животных разделили на четыре группы: I (4 гол., интактные особи) служила контролем; овцы II (5 гол.), III (9 гол.) и IV групп (9 гол.) ежедневно в течение 90 сут получали с рационом нитрат свинца (5 мг/кг, 25 мг/кг и 150 мг/кг корма). Содержание свинца в рационе животных из II группы соответствовало 1 МДУ (максимально допустимый уровень) металла в кормах, III — 5 МДУ и IV — 30 МДУ. Нитрат свинца задавали с комбикормом 1 раз в сутки с учетом количества корма (в среднем 2 кг), поступающего в желудочно-кишечный тракт. Для этого 100 г комбикорма смешивали с 50 мл раствора нитрата свинца нужной концентрации. Суточное поступление металла в среднем на 1 гол. для овец II группы составило 10 мг, III группы — 50 мг, IV группы — 300 мг, а доза воздействия соответственно 0,3; 1,5 и 9 мг/кг живой массы. Органы (печень, почки, селезенка) отбирали после убоя животных: перед началом эксперимента (до затравки) — 1 гол. из I группы, на 30-е и 60-е сут интоксикации — по 1 гол. из II группы и по 3 гол. из III и IV групп, на 90-е сут — по 3 гол. из каждой группы.

Содержание МТ в тканях органов оценивали радиохимическим методом (22, 23), который основан на замещении ¹⁰⁹Cd ионов металла, хелатированных в МТ. Образцы тканей гомогенизировали в Трис-HCl буфере (0,1 М, pH 8,2) и доводили объем до 2 мл. Для денатурации высокомолекулярных белков надосадочную жидкость прогревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин, затем охлаждали на льду и центрифугировали 7 мин при 16000 g и 4 ° C. К 0,2 мл индикаторного реагента добавляли 0,2 мл пробы, перемешивали и инкубировали 10 мин при 20 ° C. Для приготовления индикаторного реагента к 1 мл Трис-HCl буфера добавляли 40 мкл ¹⁰⁹CdCl 2 и 20 мкл CdCl₂ (концентрация 100 мкг/мл). В пробирки с образцами вносили 0,1 мл 2 % раствора гемоглобина (стандарт фирмы «Агат», Россия), перемешивали и прогревали на кипящей водяной бане 3 мин с последующим охлаждением на льду. Аналогичную процедуру проводили дважды. Далее пробы центрифугировали 15 мин при 3900 g и 4 ° C и отбирали супернатант (0,2 мл).

Для каждой серии измерений анализировали холостую пробу (вместо исследуемого образца вносили 0,2 мл буфера) и общую активность (исследуемую пробу и гемоглобин заменяли на буфер — стандарт).

Для расчета количества МТ в образцах использовали формулу (22): M = [17,8-V-(A - К)•C-1]•m-1, где М — количество МТ, мкг/г ткани; V — кратность разбавления образца; 17,8 — количество кадмия в пробе, нмоль/мл, что соответствует количеству МТ в пробе, мкг (значение, используемое для пересчета); m — масса навески, г; А, К, С — число распадов соответственно в пробах, холостой пробе и стандарте. Радиоактивность проб измеряли на низкоэнергетическом у-спек-трометре с полупроводниковым детектором СО-05П1 («Аспект», Россия).

Клеточность и индекс массы органов определяли общепринятыми методами (24). Предварительно взвешенный биоматериал из средней части органа растирали тефлоновым пестиком в пробирке с небольшим объемом среды (140 мM NaCl, 5 мM KCl, 5 мM HEPES буфер, pH 7,4 ) . Для почек и печени объем среды составлял 2 мл, для селезенки — 4 мл. Гемолиз эритроцитов в суспензии клеток проводили с помощью жидкости Тюрка. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и через 2 мин отбирали супернатант для подсчета клеток в камере Горяева. Клеточность органов определяли по формуле: К = Y/m, где m — масса навески, мг; Y — число клеток. Для расчета индекса (коэффициента) массы органов использовали 841

формулу И = m1/M1, где m1 — масса органа, кг; M1 — живая масса овцы, кг.

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t -критерия Стьюдента. Различия значений считали достоверными при p < 0,05 (25).

Результаты . Содержание МТ в печени у интактных овец (контроль) составило 168±16 мкг/г ткани (рис., А). У животных II группы (1 МДУ) величина показателя в течение первых 60 сут интоксикации соответствовала контролю, а на 90-е сут превышала его в 2,1 раза (р < 0,05). С увеличением поступления металла с рационом количество МТ в печени овец III (5 МДУ) и IV групп (30 МДУ) достоверно возрастало во все сроки исследования.

А

Б

Содержание металлотионеинов в печени (А) , почках (Б) и селезенке (В) у овец романовской породы при хроническом поступлении свинца с рационом: 1 — I группа (контроль), 2 — II группа (1 МДУ, 5 мг/кг корма), 3 — III группа (5 МДУ, 25 мг/кг корма), 4 — IV группа (30 МДУ, 150 мг/кг корма) (виварий Всероссийского НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, г. Боровск, Калужская обл.). МДУ — максимально допустимый уровень; серая область — значения в контроле (среднее и ошибка среднего).

Так, у животных III группы величина показателя на 30-е, 60-е и 90-е сут была выше контроля соответственно на 11 %, 77 % (р < 0,05) и 88 % (р < 0,05). В то же время у овец IV группы максимальное количество МТ в печени регистрировали на 30-е сут интоксикации (335 % от контроля). На 60-е и 90-е сут отмечали снижение содержания МТ в этом органе, хотя значения показателя достоверно превышали контроль соответственно на 73 и 66 % (р < 0,05).

Действительно, у животных II группы на 30-е и 60-е сут интоксикации число клеток в печени возросло соответственно на 62 и 100 % (табл.). Наиболее выраженные изменения показателя наблюдали с увеличением количества металла в рационе. В тканях печени у овец III и IV групп на 30-е, 60-е и 90-е сут число клеток увеличивалось на 52 % (р < 0,05), 106 % (р < 0,05), 176 % и 150 % (р < 0,05), 164 % (р < 0,05), 164 % (р < 0,05). В то же время индекс массы органа у подопытных животных возрастал практически во все сроки исследования (см. табл.). Достоверное повышение значений показателя у овец III и IV групп отмечали на 30-е и 60-е сут. Наиболее выраженные изменения наблюдали у животных IV группы.

Полученные результаты свидетельствовали о компенсаторной реакции организма, однако снижение содержания МТ в тканях печени у овец IV группы на 60-е и 90-е сут при повышении числа клеток в органе позволяет говорить об ингибировании синтетической активности гепатоцитов и развитии негативных процессов. На то же указывают результаты оценки накопления свинца в печени в эти сроки (данные не приведены). 842

Клеточность и индекс массы органов у овец романовской породы в зависимости от дозы и сроков хронического поступления свинца с рационом ( M ± m , виварий Всероссийского НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, г. Боровск, Калужская обл.)

Группа	Pb2+, мг/кг корма	Клеточность, ½103 кл/мг ткани			Индекс массы органа, ½10-4
		30 сут	60 сут 1	90 сут	30 сут	60 сут 1	90 сут
			Печень
I	0	Усредненное значение 14,3±1,0			Усредненное значение 11,2±0,4
II	5	23,1	28,6	16,1±1,4	16,1	14,9	11,8±0,3
III	25	21,7±0,7*	29,4±5,1*	39,4±21,5	14,3±0,7*	14,2±1,0*	11,1±0,4
IV	150	35,7±1,9*	37,7±9,2*	37,7±5,9*	15,6±0,9*	14,8±1,2*	12,0±0,3
			Почки
I	0	Усредненное значение 14,0±0,9			Усредненное значение 19,5±1,2
II	5	12,3	16,3	18,8±1,2*	22,6	19,7	20,9±0,5
III	25	18,7±1,1	14,7±1,1	11,8±7,9	24,0±1,2*	21,5±0,5	22,2±0,5
IV	150	16,2±7,9	11,9±1,2	8,4±0,2	23,6±0,9*	24,8±0,5*	37,2±7,4*
			Селез	енка
I	0	Усредненное значение 35,2±0,5			Усредненное значение 12,0±2,0
II	5	48,2	27,8	42,7±1,6*	12,0	10,3	11,3±1,4
III	25	64,6±1,0*	36,1±2,3	31,1±4,3	11,5±0,9	12,1±1,2	12,2±1,2
IV	150	62,6±7,0*	60,9±4,9*	33,1±3,0	13,8±1,7	10,8±1,3	12,4±1,1
Приме	ч е ни е. Описание групп см.		в разделе «Методика».
* Различия с контролем достоверны при р < 0,05.

В почках у интактных овец (см. рис., Б) количество МТ составляло 166±23 мкг/г ткани. У животных из II группы на 30-е сут значения этого показателя были ниже контроля. В последующие сроки количество МТ повышалось. Аналогичную динамику регистрировали и с увеличением содержания свинца в рационе. Так, на 30-е сут у овец III группы отмечали снижение содержания МТ на 54 % относительно контроля (р < 0,05). На 60-е и 90-е сут этот показатель повышался. В то же время у животных из IV группы на 30-е сут наблюдения содержание МТ достоверно не отличалось от контрольных значений, а на 60-е и 90-е сут — превышало контроль соответственно на 69 % (р < 0,05) и 39 %. Низкие значения показателя на 30-е сут интоксикации можно объяснить ингибированием синтеза МТ в клетках, специфичностью изоформы МТ и клеточностью органа. Так, у животных из II группы число клеток в почках возрастало на 34 % (р < 0,05) на 90-е сут интоксикации (см. табл.). У животных III и IV групп клеточность органа была выше контроля на 30-е сут (34 % и 16 %). В последующие сроки у них отмечали тенденцию к снижению числа клеток: на 90-е сут оно было ниже контроля соответственно на 16 и 40 %. Вероятно, наблюдаемые различия между группами зависели от содержания металла в органе. Предполагается, что низкие количества свинца в почках активируют пролиферативные процессы, а высокие, напротив, вызывают гибель клеток.

Определение индекса массы почек выявило рост величины показателя (см. табл.). Достоверные отличия от контроля у животных в III группе регистрировали на 30-е сут, в IV — во все сроки исследования.

Необходимо подчеркнуть, что изменения содержания МТ в почках носили нелинейный характер. Снижение этого показателя на 30-е сут интоксикации при увеличении числа клеток позволяет говорить об угнетении их синтетической активности и развитии негативных процессов. В пользу этого можно привести данные об увеличении индекса массы органа при одновременном уменьшении числа клеток на 60-е и 90-е сут.

В тканях селезенки у овец в I группе содержание МТ составило 100,5±4,4 мкг/г (см. рис., В). У животных из II группы на 30-е и 60-е сут интоксикации величина показателя снижалась соответственно на 40 % (р < 0,05) и 20 %. На 90-е сут содержание МТ достоверно превышало контроль на 56 % (р < 0,05). С увеличением количества свинца в рационе низкие значения показателя регистрировали практически во все сроки исследования. Так, у овец III группы интенсивность синтеза МТ была ингибирована соответственно на 43 % (р < 0,05), 47 % (р < 0,05) и 20 % (р < 0,05), IV группы — на 40 % (р < 0,05), 30 % (р < 0,05) и 14 %.

Число клеток в селезенке у животных II группы на 30-е сут интоксикации было выше контроля на 37 % (см. табл.). На 60-е сут наблюдали тенденцию к снижению величины этого показателя, хотя к 90-м сут число клеток в органе достоверно возрастало. У овец из III и IV групп значения показателя превышали контроль в течение первых 60 сут, а затем уменьшались. В то же время определение индекса массы селезенки не обнаружило существенных различий относительно контроля во всех группах.

Нелинейная динамика числа клеток в селезенке при отсутствии изменений индекса массы свидетельствовала о формировании компенсаторных реакций. Однако ингибирование синтеза МТ в спленоцитах скорее указывало на развитие негативных процессов.

Сравнительный анализ полученных данных выявил различия в содержании МТ в органах. В печени и почках овец количество МТ было выше, чем в селезенке. При хроническом поступлении свинца с рационом в печени наблюдали увеличение значений показателя, а в селезенке, напротив, снижение. В почках изменения количества МТ носили нелинейный характер. Вероятно, базальный уровень МТ в клетках органов характеризует их чувствительность к воздействию свинца. В то же время интенсивность синтеза МТ при одинаковой концентрации свинца может быть различной (26, 27). Более того, увеличение содержания МТ в органе может быть связано с процессами регенерации и(или) пролиферации.

Действительно, у интактных овец значение клеточности в селезенке составило (35,2±0,5)½104, в почках — (14,0±0,9)½104, в печени — (14,3±1,0)½103 клеток/мг ткани. Следовательно, по числу клеток в органе можно представить последовательность: селезенка > почки > печень. При поступлении свинца изменения в органах носили разнонаправленный характер. В печени число клеток возрастало в течение всего периода исследования, в селезенке и почках — лишь на 30-е сут, после чего наблюдали его снижение. В тканях печени и почек интенсивность накопления свинца была выше, чем в селезенке, поэтому полученные результаты позволяют говорить о чувствительности спленоцитов. Возможно, одним из факторов высокой чувствительности клеток селезенки к воздействию свинца был низкий уровень конститутивной экспрессии МТ. Необходимо подчеркнуть, что при хроническом поступлении свинца изменение индекса массы органа наблюдали только для печени и почек.

Таким образом, хроническое поступление свинца с рационом в дозах 5 (1 МДУ), 25 (5 МДУ) и 150 мг/кг корма (30 МДУ) приводило к увеличению содержания металлотионеинов (МТ) в печени, а также числа клеток и индекса массы органа. Наиболее существенные нарушения наблюдали у животных IV группы (30 МДУ). В почках отмечали нелинейный характер изменений количества МТ. Его снижение на 30-е сут при увеличении числа клеток в почках свидетельствует об угнетении синтетической активности клеток, а рост индекса массы органа при одновременном уменьшении числа клеток на 60-е и 90-е сут — о развитии негативных процессов. В селезенке наблюдали ингибирование синтеза МТ и нелинейный характер изменения клеточности. Полученные результаты указывают на развитие негативных процессов в печени, почках и селезенке, что связано, с одной стороны, с интенсивностью накопления свинца, с другой — с чувствительностью клеток этих органов к токсическому воздействию металла. 844

Установлено, что содержание МТ в тканях печени и почек у интактных овец было выше, чем в селезенке, а число клеток — ниже. Предполагается, что один из факторов высокой чувствительности спленоцитов к воздействию свинца — низкий уровень конститутивного синтеза МТ.