Сохранение штаммов грибов из рода Fusarium, поражающих подсолнечник, в культуре на разных субстратах и температурных режимах

Введение. Грибы рода Fusarium Link. широко распространены в природе и являются возбудителями болезней более 200 видов культурных растений (хлебные злаки, технические и овощные культуры, а также древесные породы), вызывая их увядание, гнили и гибель. Грибы этого рода относятся к группе факультативных полифаговых паразитов с различной степенью паразитизма, среди них имеются достаточно резко выраженные паразиты растений, полупаразиты и сапрофиты [1]. Поражение ими растений не только снижает урожай [2; 3; 4; 5; 6], но и значительно ухудшает его качество [7]. Одним из факторов вредоносности грибов рода Fusarium являются продуцируемые в процессе жизнедеятельности токсичные вторичные метаболиты – микотоксины (фузариотоксины), которые накапливаются в органах вегетирующего растения, в результате чего, например, у злаковых культур, зерно становится непригодным для использования в пищу и на корм скоту [8]. Симптомы поражения подсолнечника, вызываемые возбудителем различных видов фузария, включают гниль корней и корзинки, увядание и пятнистость [2]. Искусственное заражение растений подсолнечника для селекции устойчивых форм предполагает необходимость длительного хранения инфекционного начала возбудителей фузариоза в лабораторных условиях с сохранением их агрессивных свойств. Разработка подходов к поддержанию коллекций чистых культур штаммов микромицетов ведется уже давно во многих странах мира, и к настоящему времени существуют несколько различных методов как кратковременного, так и долгосрочного хранения [9; 10]. На данный момент все большее распространение получают методы криоконсервации [11; 12]. При этом микроорганизмы не утрачивают жизнеспособность в течение десятилетий. Тем не менее методы непродолжительного хранения являются одними из самых простых, не требующих дорогостоящего оборудования и в то же время незаменимых в повседневной работе с микроорганизмами [13]. Однако при многократных пересевах повышается вероятность реверсии и потери активности микроорганизма, а также увеличивается риск контаминации культур и вырождения исходных изоля-тов [14]. При этом для использования в селекции необходимо применять наиболее агрессивные штаммы патогенов. Таким образом, совершенствование методов хранения рабочей коллекции возбудителей болезней не теряет актуальности.

Цель исследований ‒ провести сравнительный анализ сохранения в чистой культуре на разных субстратах и температурных режимах агрессивности штаммов двух видов грибов из рода Fusarium , поражающих подсолнечник.

Материалы и методы. Объектами служили штаммы Fusarium sporotrichioi-des Sherb . и Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans . var. orthoceras (Appl. et Wr.) Bilai, выделенные в чистую культуру на питательную среду (сусловый агар) из пораженных корней растений подсолнечника. Выделение в чистую культуру и идентификацию возбудителей фузариоза проводили в соответствии с систематикой и методами Билай В.И. и Шипиловой Н.П., Иващенко В.Г. [1; 15].

Для получения среды на стерильной растительной основе (лузга, семянки и фрагменты стеблей подсолнечника) в колбы объемом 200 мл помещали равное количество поверхностно промытого под проточной водой и подсушенного субстрата (100 г). Колбы закрывали фольгой, сверху пергаментной бумагой, фиксировали резинкой и стерилизовали в течение 40 минут при давлении 1,2 атм. и температуре 120 °С. После стерилизации в емкости высевали агаровые блоки размером 1 × 1 см, высеченные из 14-дневных ко- лоний чистых культур видов возбудителей фузариоза. Закрытые колбы со стерильными субстратами и высеянными на них агаровыми блоками чистых культур инкубировали в термостате 30 дней при температуре 23 °С. Затем покрытый мицелием субстрат в колбах оставляли на хранение в течение пяти месяцев при двух температурных режимах. Для штаммов Fusarium oxysporum var. orthoceras и F. sporotrichioides использовали семянки и лузгу и культивировали при температуре 22–28 °С, при +4 °С ‒ фрагменты стеблей и лузгу. По каждому субстрату выборка составляла по 20 проростков в трехкратной повторности.

После каждого месяца хранения фуза-рии пересевали на поверхность питательной среды – сусловый агар в чашки Петри и культивировали при температуре 23 °С в течение 14 дней до полного заполнения всей поверхности агара колонией гриба. Далее определяли степень агрессивности культуры: крышку чашки Петри заменяли на перфорированную с 20-ю сквозными отверстиями, в которые помещали двухдневные очищенные от лузги проростки подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 так, чтобы кончик корня был погружен в колонию гриба. После 6-часовой экспозиции крышку с зараженными проростками переносили на чашку Петри, дно которой было выстлано фильтровальной бумагой, смоченной стерильной водой, и накрывали полиэтиленовой пленкой, создавая влажную камеру при комнатной температуре. Через три дня проводили визуальную оценку иммунологической реакции растения по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль по иммунологической 5-балльной шкале (рис. 1) [16]:

0 баллов ‒ здоровые проростки;

• 1    балл ‒ сгнил кончик корня;

• 2    балла ‒ перетяжка гнили в середине корня или сгнило 50 % корня;

• 3    балла ‒ сгнил корень до корневой шейки;

• 4    балла ‒ сгнил корень и гипокотиль.

Рисунок 1 ‒ Проростки подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 после искусственного заражения возбудителем фузариоза, распределенные в соответствии с баллами иммунологической шкалы

По интенсивности поражения проростков подсолнечника фузариозом определяли развитие болезни по формуле [17]:

R =      100 %,

Ж • к)       , где R ‒ развитие болезни, %;

Σ(a ‧ b) ‒ сумма произведений числа растений на соответствующий им балл поражения;

N ‒ общее число учетных растений (здоровые и больные);

k ‒ высший балл шкалы учета.

Результаты экспериментов анализировали методом дисперсионного анализа в компьютерной обработке [18].

Результаты и обсуждение. В процессе хранения штаммов обоих видов, как F. sporotrichioides, так и F. oxysporum var. оrthoceras, на каждом субстрате (лузге, семянках и фрагментах стеблей) происходил обильный рост воздушного мицелия и спорообразование. По мере старения культур наблюдалось образование многочисленных толстостенных покоящихся хламидоспор в мицелии (гифах грибницы) и утолщение оболочек микро-и макроконидий. Как известно, большин- ство фузариевых грибов могут существовать как сапрофиты на растительных остатках не один год. Они играют важную роль в биоценотическом круговороте, участвуя в процессах деградации целлюлозы, лигнина и других субстратов [8]. Поэтому растительные остатки являются одним из основных источников инфекции. При попадании в благоприятные условия инфекционное начало гриба прорастает новым мицелием и способно проникать и развиваться в сосудистой системе многих растений.

В результате реизоляции изучаемых видов гриба из исследуемых субстратов на агаризованное пивное сусло через каждый месяц хранения установлено, что анализируемые штаммы не утрачивали свою жизнеспособность, а микроморфо-логические и морфолого-культуральные признаки сохраняли стабильность. Степень поражения корневой системы проростков подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 при инокуляции пропагулами гриба в чашках Петри изменялась, в зависимости от субстрата, температуры и сроков хранения патогена. При хранении культур F. sporotrichioides в колбах при температуре +22–28 °С в течение пяти месяцев агрессивность их снижалась на семянках от 67,5 до 47,2 %, на лузге – от 62,7 до 42,2 %. Интенсивность развития болезни существенно снизилась на 3-й месяц на семянках и составила 52,5 %, на 4-й месяц на лузге ‒ 46,1 % (рис. 2). Аналогичные данные наблюдали при хранении в течение пяти месяцев менее патогенного штамма F. oxysporum var. orthoceras: агрессивность снижалась от 36,9 до 20,0 % на семянках, от 31,2 до 5,5 % на лузге. Достоверные изменения произошли на семянках: на 3-й месяц интенсивность развития болезни составила 21,2 %, на лузге – на 4-й месяц 17,5 % при наименьшей существенной разности 11,4.

Рисунок 2 – Агрессивность для проростков подсолнечника штаммов F. sporotrichiella var. sporotrichioides и F. oxysporum var. orthoceras, хранившихся на стерильных семянках и лузге, в зависимости от сроков хранения при температуре +22–28 °С

Хранение штамма F. sporotrichioides на фрагментах стеблей и лузге подсолнечника в колбах при низкой температуре +4 °С показало, что после пяти месяцев агрессивность существенно не изменялась (при P < 0,05) (рис. 3). Интенсивность поражения корневой системы проростков подсолнечника при контакте с колонией гриба, посеянной с лузги, составила 58,3 % в сравнении с первым месяцем хранения (66,9 %), с фрагментов стеблей – 60,0 % при начальном значении 69,9 %. Агрессивность штамма F. oxysporum var. or-thoceras снизилась через четыре месяца хранения на двух субстратах и составила: с лузги ‒ 23,8 %, с фрагментов стеблей подсолнечника ‒ 24,6 % в сравнении со значениями первого месяца хранения 38,0 % при наименьшей существенной разности 12,4.

Рисунок 3 – Агрессивность для проростков подсолнечника штаммов

F. sporotrichioides и F. oxysporum var. or-thoceras , хранившихся на стерильных фрагментах стеблей и лузге, в зависимости от сроков хранения при температуре +4 °С

Таким образом, полученные данные показали возможность сохранять и поддерживать чистоту штаммов возбудителей фузариоза подсолнечника, их агрессивность на доступных субстратах, что сокращает частоту пересевов и позволяет продолжительно проводить иммунологические и другие исследования.

Заключение. Хранение штаммов F. sporotrichioides и F. oxysporum var. or-thoceras без потери их агрессивных свойств в условиях культивирования +22– 28 °С на семянках и лузге подсолнечника возможно в течение трех месяцев. Температура +4 °С позволяет сохранять агрессивность культур указанных видов на фрагментах стеблей и лузге в течение 4–5 месяцев. При этом штамм более агрессивного вида F. sporotrichioides не утрачивает своих патогенных свойств на протяжении более длительного времени (пять месяцев).