Сохранность лейкоцитов в условиях криоанабиоза

Для реализации потребности в лейкоцитах перед клиницистами остро встает проблема сохранения данных клеток длительное время в функционально полноценном состоянии, что возможно в условиях глубокого криоанабиоза (-1960С). Данный способ консервирования по ряду причин не доступен для широкого применения. Поэтому целью работы явилась разработка эффективного, доступного и экономичного способа сохранения лейкоцитов при умеренно-низкой температуре -400С. Показано, что применение данного способа позволяет сохранять ядерные клетки крови в функционально полноценном состоянии до 30 суток.

В настоящее время в связи с расширением показаний к применению концентратов лейкоцитов (лейкопения, гипо- и апластические состояния кроветворения, тяжелый сепсис и др.) возникла проблема создания их запасов. На протяжении многих лет ряд ученых (Пушкарь Н.С. и др., 1978; Аграненко В.А. и др., 1982) ведет поиск оптимальных методов замораживания и длительного хранения лейкоцитов. Немногочисленные данные литературы (Махатадзе И.К. и др., 1975; Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994) свидетельствуют о том, что в настоящее время единственным эффективным методом долгосрочного хранения гранулоцитов является их замораживание при ультранизкой ( –1960С) температуре.

Сохранение жизнеспособности лейкоцитов крови при положительных температурах встречает значительные трудности в связи с быстрым затуханием энергетического обмена, что в свою очередь связано с более сложной внутренней структурой клеток. Так, например, мембраны гранул лейкоцитов весьма чувствительны к любого рода воздействиям (изменению рН, температуры среды и т.д.) и при нарушении их целостности, содержащиеся в гранулах гидролитические ферменты (фагоцитин, лизоцин), выходят в цитоплазму клетки, вызывая ее гибель.

Накопленный опыт по хранению ядерных клеток крови свидетельствует о том, что продлить жизнеспособность лейкоцитов в условиях положительных температур, т.е. при +40С возможно до 24 часов (Заривчатский М.Ф., 1995), при температуре от 0 до –40С в течение 48 часов (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994), при низкой температуре (-800С) - 12 месяцев (Утемов С.В. и др., 1999; Сведенцов Е.П. и др., 2001), при ультранизкой (–1960С) - в среднем до 20 месяцев (Аграненко В.А. и др., 1982). Следует отметить, что существующие методы замораживания до -196°С и хранения при данной температуре требуют применения дорогостоящего оборудования, жидкого азота и обслуживания высококвалифицированного персонала, что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой и экономически неэффективной и не позволяет вводить ее в широкую практику. Поэтому весьма актуальным является создание простого, эффективного и экономичного метода криоконсервирования лейкоцитов, но без использования жидкоазотной технологии. Приоритетность данной темы исследования обусловлена особенно тем, что в доступной отечественной и зарубежной литературе сведений о методах, позволяющих сохранить функцию лейкоцитов, в том числе гранулоцитов, при умеренно-низкой (-400 С) температуре не имеется. На основании выше указанного была сформулирована следующая цель исследования: разработать эффективный, доступный и экономичный способ сохранения лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (400С).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служил концентрат лейкоцитов (ЛК), выделенный из цельной донорской крови при цитаферезе. Полученное количество ЛК в среднем составляло 21,27±5,3 мл. Смешивание ЛК с криоконсервантом, включающим в себя криопротектор гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (ГМБТОЭМ), антигипоксант фумарат натрия и лимонную кислоту (Патент на изобретение №2184449), производили в соотношении 1:1 и эквилибрировали при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого клеточная взвесь подвергалась       замораживанию       по экспоненциальной программе до –400С. Для этого подготовленный биообъект погружали в заполненную хладоносителем (96% этиловым спиртом)            4-литровую ванну камеры электроморозильника «Криостат», охлажденную до   -28оС. После 18 минут экспозиции в данной камере биоматериал переносили в электроморозильник с температурой -400С для дальнейшего   замораживания   и хранения.

Регистрацию   температуры   замораживания осуществляли с помощью прибора ГСП – 04, датчик которого был установлен в одном из контейнеров с имитатором – криоконсервантом с конечной концентрацией его ингредиентов, как при смешивании с ЛК. При температуре –400С биообъект с предложенным криоконсервантом хранили 1 и 30 суток. Быстрое размораживание ЛК производили в 20-литровой водяной ванне при температуре +380С в течение 45-60 сек (в зависимости от объема ЛК) при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в секунду) для предотвращения процессов рекристаллизации до температуры биообъекта +20С++40С.

Изучение функциональных свойств лейкоцитов осуществляли до введения в холодовой анабиоз и после выхода из него по общепринятым лабораторным методикам: определение эозинорезистентности лейкоцитов (Shreck R., 1936), изучение фагоцитарной активности нейтрофилов (Потапова С.Г. и др., 1977), проведение оценки окислительновосстановительного метаболизма нейтрофилов по НСТ-тесту (Гольдберг Е.Д. и др., 1992), изучение функционального состояния нейтрофилов с помощью лизосомально-катионного теста (Славинский А.А., Никитина Г.В., 1999), оценка содержания Т- и В-лимфоцитов в ЛК с помощью моноклональных антител в непрямом иммунофлуоресцентном тесте (Кондратьева И.А., Ярилин А.А., 2004).

Результаты исследования (всего 456 наблюдений), обработаны методами параметрической статистики; результаты выражали в виде М±о, а различия оценивали по критерию Стьюдента (Гланц С., 1998); их считали достоверными при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение эозинорезистентности лейкоцитов показало, что после размораживания через 1 и 30 суток холодового анабиоза наблюдалось достоверное (р<0,05) снижение уровня клеток с сохраненным свойством избирательной проницаемости мембраны. Относительные данные свидетельствуют о том, что после 30 суточного хранения количество жизнеспособных лейкоцитов было достоверно (р<0,05) ниже – 70,1±14,9%, чем после хранения в течение 1 суток – 84,3±6,6%.

Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов (процентное отношение фагоцитирующих клеток к общему числу сосчитанных) показало (табл.1, рис.1, 2), что образование фагосом, содержащих поглощенные частицы латекса, наблюдалось в течение 1 и 30 суток хранения биообъекта в условиях холодового анабиоза (–400С) без достоверного отличия как от исходного уровня, так и указанных сроков хранения. Однако прослеживалась тенденция к снижению фагоцитарной активности к 30 суткам.

Процент активированных нейтрофилов, т.е. содержащих диформазан, достоверно (p<0,05) увеличивался после размораживания (табл.1), что, согласно данным литературы (Granfeldt D. et al., 2002; Зинкин В.Ю., Годков М.А., 2004), отражает проявление респираторного взрыва нейтрофилов. Спустя сутки хранения этот показатель возрастал в 3,1 раза, после 30 суток хранения рост этого показателя был более выраженным (p<0,05) – 4,3 раза.

Определение содержания соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофилов без участия кислорода с помощью лизосомально-катионного теста показало (табл.1), что средний цитохимический коэффициент (СЦК) достоверно (p<0,05) снижался после размораживания через все сроки хранения. Кроме того, данный показатель после 30 суточного хранения в условиях холодового стресса оказался достоверно (p<0,05) ниже в отличие от хранения в течение 1 суток.

При умеренно-низкой температуре -40оС после размораживания исследуемой биосреды через одни сутки наблюдалось достоверное (p<0,05) увеличение в ней численности Т-лимфоцитов и снижение В-лимфоцитов (табл.2) в сравнении с исходным (до замораживания) уровнем.

Таблица 1 Функциональное состояние нейтрофилов, перенесших холодовой анабиоз (-40оС) разной длительности

Сроки Хранения (сутки)	Количество фагацитарно активных НФ			Количество диформазанположительн ых НФ		СЦК по ЛКТ
	до замор.	после размор.		до замор.	после размор.	до замор.	после размор.
	в % к общему числу НФ	в % к общему числу НФ	в % к исх. уровню	в % к общему числу НФ	в % к общему числу НФ	В у.е.	В у.е.	в % к исх. уровню
1	41,9±4,7	39,8±3,6	95,9±4,5	21,75±3,9	67,33±6,4*	2,3±0,5	1,6±0,3*	81,8±12,4
30	46,7±5,2	43,0±6,8	92,2±6,4	22,33±1,9	96,80±7,2*#	1,1±0,1#	1,1±0,2#	102,0±9,1#

Примечание: НФ – нейтрофилы, ЛКТ – лизосомально-катионный тест, СЦК – средний цитохимический коэффициент; * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (p<0,05); # -различие с данными через 1 сутки достоверно (p<0,05).

Таблица 2 Содержание Т и В-лимфоцитов в лейкоконцентратах, подвергнутых холодовому воздействию (-40^оС) разной длительности

Состояние ЛК (n=5)		Т-лимфоциты, %	В-лимфоциты, %
ЛК, смешанный с криоконсервантом 1:1	до замораживания	82,80±1,92	9,25±3,86
	после размораживания	88,33±2,08 *	2,67±0,58 *

Примечание : ЛК- лейкоцитный концентрат; * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (p<0,05).

Рис. 1. Нейтрофил, фагоцитировавший частицы латекса до замораживания (увеличение в 1500 раз)

Рис. 2. Нейтрофил, фагоцитировавший частицы латекса после оттаивания (увеличение в 1500 раз)

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению механизмов криоповреждения и криозащиты ядерных клеток крови (Иткин Ю.А. и др., 1983; Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994; Svedentsov E.P. et al., 1998; Halle P. et al., 2001), проблема сохранения этих объектов еще далека от своего окончательного разрешения.

Степень криоповреждения в первую очередь определяется глубиной анабиотического состояния клетки. Во избежание механического разрушения мембран клетки и ее органелл образующимися кристаллами при фазовом переходе вода-лед и денатурации клеточных белков при повышении концентрации солей в межкристаллических пространствах нами был использован отечественный криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ (Сведенцов Е.П. и др., 1997), который стабилизирует как фракции внеклеточной воды, так и внутриклеточной. Показано (Осташко В.Ф., Осташко Ф.И., 2004), что температурный шок смягчается или вообще не проявляется при медленном экспоненциальном снижении температуры клеточной суспензии. Использование данной программы позволяет избежать процессов рекристаллизации в процессе замораживания биообъекта. Кроме того, экспоненциальная программа замораживания не требует применения дорогостоящей жидкоазотной технологии и является весьма экономичной. Вероятно, используемый нами криопротектор, позволяющий избежать глубоких фазовых изменений и нарушения барьерных свойств мембран лейкоцитов, а также примененная экспоненциальная программа замораживания позволили нам сохранить большой процент (70,1±14,9%) жизнеспособных клеток после их размораживания.

Лейкоциты в отличие от других клеток крови обладают повышенным обменом веществ, который при умеренно-низкой температуре (-40оС) замедляется, но продолжается, так как в клетках в незамерзшем состоянии остаются часть связанной и вся фракция фиксированной воды; поэтому энергетические запасы лейкоцитов продолжают расходоваться (Сведенцов Е.П., 2004). Для поддержания метаболизма лейкоцитов в состав хладоограждающего раствора нами был включен антигипоксант биоэнергетической направленности фумарат натрия, который необходим для нормализации цикла Кребса в клетках как во время воздействия холодового стресса, так и после него. Нами было установлено, что после нахождения нейтрофилов в состоянии холодового анабиоза при -40°С количество НСТ-положительных клеток существенно увеличивалось и после 30 суток хранения резервные функции системы, генерирующей активные формы кислорода, были использованы почти полностью. Таким образом, применение данной ограждающей среды и экспоненциальной программы замораживания позволяет поддерживать метаболизм нейтрофилов, подвергнутых холодовому стрессу (-40°С) до 30 суток.

Образование кислородных радикалов является подготовительным этапом фагоцитоза (Герасимов И.Г., 2004). Полученные нами данные в НСТ-тесте коррелируют с результатами определения способности нейтрофилов к фагоцитозу. Нами установлено, что через 30 суток холодового анабиоза 92,2±6,4% нейтрофилов сохраняют способность к образованию фагосом с инертными частицами латекса.

Данные литературы свидетельствуют (Обозная Э.И. и др., 1981; Славинский А.А., Никитина Г.В., 1999), что лизосомально-катионные белки локализуются как в первичных пероксидазопозитивных (азурофильных), так и во вторичных            пероксидазонегативных

(специфических)    гранулах нейтрофилов.

Согласно результатам лизосомально-катионного теста наблюдается достоверное (p<0,05) снижение СЦК к 30 суткам. Мы предполагаем, что это может быть связано с повреждением первичных и вторичных гранул нейтрофилов в процессе длительного холодового воздействия.

Среди лейкоцитов лимфоциты являются наиболее устойчивыми к действию холода клетками, кроме того, устойчивость В-лимфоцитов к замораживанию до -196°С выше, чем Т-лимфоцитов (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994). Нами установлено, что при умереннонизкой температуре    -40оС    наиболее чувствительными к холодовому стрессу оказались В-лимфоциты. Таким образом, при различных температурных воздействиях популяции лимфоцитов ведут себя неоднозначно, что может быть использовано в практике для обогащения трансфузионной среды необходимой фракцией лимфоцитов.

Таким образом, предложен эффективный, доступный и экономичный способ сохранения лейкоцитов при умеренно-низкой температуре -40°С в функционально полноценном в течение 30 суток. Данный способ может быть рекомендован к использованию в научных учреждениях медицинского и биологического профиля.

Таким образом, патогенные для человека бактерии способны проникать в ткани растительного организма и колонизировать их, не вызывая при этом четко выраженных симптомов заражения, но сохраняя свою вирулентность. Это указывает на возможный риск заболевания при употреблении зараженных овощей и фруктов. .