Сорбенты фенолов как компоненты питательной среды в микроклональном размножении растений

DOI:

На приживаемость эксплантов оказывают влияние следующие факторы: стерилизующие агенты, сроки введения в стерильную культуру, исходный материал, окисление фенолами питательной среды и эксплантов, состав питательной среды. Часто при введении растений в культуру in vitro возникает довольно серьезная проблема – ингибирование ростовых процессов экспланта токсическими веществами

(фенолами), которые выделяются в среду в результате травмы при изолировании.

Выделение эксплантами фенольных соединений большинства видов в культуральную среду вызывает потемнение и препятствует регенерации растений in vitro [10; 11]. Для снятия отрицательного воздействия фенолов растительные ткани обрабатывают стабилизирующими веществами, а также используют различные сорбенты в качестве компонентов питательной среды.

Данное исследование представляет анализ способов решения обозначенной проблемы, как сорбция фенольных соединений при микроклональном размножении растений.

Соединения углерода как сорбенты фенолов

В литературе часто встречаются упоминания о добавлении в питательную среду тех или иных компонентов, препятствующих выделению вредных подавляющих рост веществ. Чаще всего в качестве адсорбирующего вещества используют различные углеродные соединения, например активированный уголь [7]. Он имеет очень тонкую сеть пор с большой внутренней поверхностью, на которой могут адсорбироваться многие вещества [25].

Количество выделяемых фенолов можно измерить методом спектрофотометрии, как описано в статье Ozyigit [18]. В данной работе автор измерял общее содержание фенольных соединений в листьях, побегах и питательной среде Мурасиге – Скуга на 7, 14, 21 и 28-й день органогенеза. Наибольшая концентрация фенолов в исследуемом материале определялась на третьей неделе онтогенеза.

Rabha Abdelwahd с соавторами проводили исследование по изучению влияния адсорбента и антиоксиданта для уменьшения воздействия выщелочных фенолов при регенерации проростков фасоли in vitro [10]. Результаты показали снижение латерального потемнения эксплантов и улучшение регенерации побегов при добавлении в питательную среду активированного угля в концентрации 10 г/л или аскорбиновой кислоты в концентрации 1 мг/л. Экспланты проращивали на среде Мурасиге и Скуга с 3 % сахарозой, 0,8 % агаром, с содержанием фитогормонов 2 мг/л 6-бензилами-нопурина и 2 мг/л тидиазурона. В результате был сделан вывод о положительном адсорбирующем действии активированного угля, благодаря которому улучшилась регенерация экспланта в условиях in vitro .

В 2006 г. была опубликована работа на тему влияния активированного угля на культуру тканей in vitro [23]. Исследование проводилось на суспензии клеток дикой моркови (Daucus carota) и гаплопаппуса (Haplopappus gracilis) и суспензии каллусов лука многоярусного (Allum cepa var. proliferum) на питательной среде с активированным углем и без него. Дифференциация произошла в тех культурах клеток, которые содержали древесный уголь. Методом масс-спектрометрии было показано, что питательная среда без древесного угля содержит большое количество фенилуксусной кислоты и p-ОН-бензойной кислоты (Daucus), 2,6-OH-бензойной кислоты (Allium) и бензойной кислоты, пеларгоновой кислоты и каприловой кислоты (Haplopappus), а среда с активированным углем – нет. Также было показано, что p-OH-бензойная кислота оказывает ингибирующее действие на эмбриогенез в культурах тканей Daucus.

Enni Suwarsi Rahayu в своем исследовании выявляет оптимальный состав питательной среды для выращивания Элеокарпуса крупноцветкового ( Elaeocarpus grandiflorus ) в условиях in vitro [24]. В двухфакторном эксперименте, в котором варьировали тип питательной среды, Мурасиге – Скуга (MS) и питательная среда для древесных растений (WPM), а также антиоксидантные агенты, активированный уголь и поливинилпирролидон (ПВП). ПВП представляет собой адсорбирующее соединение, которое связывается с фенолами и, следовательно, предотвращает окисление. Роль активированного угля включает в себя инактивацию свободных радикалов или восстановление пероксидов. Данное исследование показало, что оба типа антиоксидантов были эффективны в развитии эксплантата E. grandiflorus. Культивирование эксплантов на среде MS с добавлением ПВП привело к тому, что большинство эксплантатов сформировали побеги, а на среде WPM, дополненной ПВП или активированным углем, большинство эксплантатов регенерировали каллус.

В.Л. Налобова и В.В. Акименко в работе по микроклональному размножению котовника гибридного использовали в качестве сорбентов несколько веществ [5]. Питательную среду Мурасиге – Скуга модифицировали ингибиторами фенолов – активированным углем (10 % от объема), витамином С (аскорбиновой кислотой) – 1 мл/л, а также увеличением доли ИМК с 0,2 до 0,5 мл/л. В процессе исследований выявлено, что на среде, содержащей активированный уголь, образовывались регенеранты в виде конгломератов, состоящих из большого количества побегов, в то же время на среде без активированного угля образуются одиночные регенеранты. Добавление в среду витамина С не вызывало каких-либо видимых изменений в развитии растений in vitro. Таким образом, был сделан вывод о том, что активированный уголь является лучшим ингибитором фенолов, чем аскорбиновая кислота.

Ученые всероссийского научно-исследовательского института сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова в одной из своих работ модифицировали питательную среду с целью укоренения эксплантов [1]. Для этого рекомендуется вводить индолилмасляную кислоту (ИМК) и нафтилуксусную кислоту (НУК) в различных концентрациях. Однако ауксины могут оказывать отрицательное влияние на процесс корнеобразования in vitro . Поэтому Е.Н. Васильченко с соавторами с целью устранения нежелательных последствий увеличения концентрации ауксинов в питательную среду добавляли активированный уголь. Внесение данного вещества в концентрации 3 мг/л оказало положительное влияние на ризогенез, а именно повышало частоту образования корней на 7,8–10,7 %.

В исследовании Roberson Dibax было обнаружено, что, помимо подавления действия фенольных соединений и, следовательно, потемнения, добавление активированного угля к питательной среде для регенерации эвкалипта in vitro усиливает рост побегов и улучшает окраску листьев [19].

В монографии Т.М. Черевченко «Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro » говорится о том, что активированный уголь часто вносят в среды для укоренения на последнем этапе микроразмножения [9]. Предполагается, что он связывает ингибиторы фитогормонов, в результате чего стимулируется эмбриогенез. А также указывается, что некоторые растения лучше развиваются на затемненной питательной среде.

Dennis Thomas в своей работе рассматривает различные аспекты применения активированного угля в качестве компонента питательной среды [25]. Он часто используется в культуре тканей для улучшения роста и развития клеток, а также играет решающую 42

роль в микроразмножении, прорастании семян орхидей, соматическом эмбриогенезе, культивировании пыльников, производстве синтетических семян, культивировании протопластов, укоренении, удлинении стебля, формировании луковиц и т. д. Промотирующие эффекты активированного угля на морфогенез могут быть обоснованы его необратимой адсорбцией ингибирующих веществ в культуральной среде и существенным снижением содержания токсических метаболитов, фенольной экссудацией и накоплением коричневого экссудата. В дополнение к этому активированный уголь участвует в ряде стимулирующих и ингибирующих действий, включая высвобождение веществ, которые способствуют росту, изменению и потемнению питательных сред, а также адсорбции витаминов, ионов металлов и регуляторов роста растений, включая абсцизовую кислоту и газообразный этилен. Влияние данного вещества на поглощение регуляторов роста до сих пор неясно, по мнению ряда исследователей активированный уголь может постепенно высвобождать определенные адсорбированные продукты, такие как питательные вещества и регуляторы роста, которые становятся доступными для растений.

В 2015 г. группа ученых исследовала применение хлорида ртути (HgCl₂) и древесного угля в микроклональном размножении тикового дерева ( Tectona grandis ) [27]. Изучено влияние HgCl₂ в различных концентрациях (0,05, 0,1 и 0,15 %) с различным временем экспозиции 5, 10 и 15 минут. Авторы обнаружили, что обработка 0,1 % HgCl₂ в течение 5 минут показала лучшее распускание почек, в то время как грибковое и бактериальное загрязнение было наименьшим при применении 1 % и 0,15 % растворов. Процент грибковых и бактериальных загрязнений были ниже при обработке 1,5 % HgCl₂ в течение 15 минут. Комбинация древесного угля с HgCl₂ оказывает значительное влияние на распускание почек и потемнение. При добавлении 0,5 г/л древесного угля с 0,01 % HgCl₂ скорость распускания почек была максимальная.

Ю.В. Береснева с соавторами в своих исследованиях описывают результаты по изучению физико-химических свойств терморасширенного графита (ТРГ) [4; 6; 8; 14]. Особенный интерес представляют конкретно сор- бционные свойства полученного терморасширенного графита: с помощью УФ-спектроскопии исследователями была определена сорбционная емкость ТРГ по отношению к растворенному в воде фенолу. Предельное значение сорбционной емкости в исследуемом диапазоне концентраций составило 6,95 г/г сорбента. Определено, что тип изотерм адсорбции зависит от природы и концентрации исследуемого вещества в растворе, а также от природы и морфологии сорбента. Таким образом, терморасширенный графит, полученный на основе соединений соинтеркалирования нитрата графита, обладает высокой сорбционной емкостью по отношению к фенолу, что наталкивает на возможность добавления ТРГ в питательную среду в качестве сорбента.

Полимеры и другие вещества как сорбенты фенолов

М.В. Скапцов с коллегами тестировали добавление в питательную среду дополнительных компонентов в отношении их влияния на накопление фенольных соединений и жизнеспособность каллусных клеток [7]. В качестве сорбента использовали поливинилпир-ролидон, а в качестве антиоксиданта – тиосульфат натрия. В результате эксперимента было установлено, что каллусы, выращенные на модицицированной среде, содержат в два раза меньше фенольных соединений, чем каллусы, выращенные на среде со стандартным составом [17].

В 2014 г. проводилось исследование с целью изучения влияния антиоксидантного действия аскорбиновой кислоты на контроль летального потемнения, вызванного фенольными соединениями, в культуре in vitro Brachylaena huillensis с использованием узловых сегментов [13; 14]. Модификация питательной среды включала добавление аскорбиновой кислоты в концентрациях 50–250 мг/л вместе с цитокинином бензиламинопурином (6-БАП). Результаты данного эксперимента показали, что выделение фенольных соединений эксплантами в значительной степени контролировалось за счет включения в среду более высоких концентраций аскорбиновой кислоты. Лучший эффект был достигнут при добавлении 200–250 мг/л аскорбиновой кислоты в среду для древесных растений (WPM) с добавлением 6-БАП.

Sanyal с соавторами в своей статье «Опосредованная Agrobacterium трансформация нута ( Cicer arietinum L .) геном cry1Ac Bacillus thuringiensis устойчивости к насекомому Helicoverpa armigera » в качестве антиоксидантов использовали 1 %-ный раствор нитрата серебра на среде Мурасиге – Скуга с индол-3-масляной кислотой (ИМК) [12]. Нитрат серебра является ингибитором этилена, его добавление поддерживало максимальное восстановление эксплантов после агроинокуляции. Добавление данного вещества привело к выделению большого количества предполагаемых трансформантов за относительно короткий период времени в культуре и устранению химер.

В 2015 г. была опубликована работа о влиянии концентрации неорганических веществ и поливинилпирролидона на корневища вишни in vitro [21]. В работе рассмотрено влияние добавления ПВП в пяти концентрациях в питательную среду различной силы на укоренение нескольких сортов вишни в условиях in vitro . В результате эксперимента были получены данные о том, что при добавлении 5 г/л ПВП к среде половинной крепости и 1 г/л ПВП число корней (5,8) было наибольшим, что привело к 80-процентному укоренению. А при применении 1 г/л ПВП в среде половинной крепости число корней составило 6,3, а процент укоренения – 90,9 %. Напротив, длина корня была максимальной (примерно 36,2 мм) в среде полной крепости без добавления ПВП. Однако, данное вещество является многообещающим средством для ингибирования фенольных соединений и укоренения в системах культур in vitro .

Qu и Chaudhury обрабатывали экспланты аскорбиновой кислотой с последующим культивированием в MS с добавлением поливинилполипирролидона, что значительно снизило потемнение и улучшило регенерацию [19].

• H.    Strosse с соавторами во время исследования культуры клеток и тканей банана в качестве антиоксидантов использовали растворы аскорбиновой и лимонной кислоты в концентрациях 10–150 мг/л [22]. Данные вещества добавляли в питательную среду для предотвращения ее потемнения, то есть с це-

• лью адсорбции фенольных соединений, или сами эксплантаты погружали в раствор антиоксиданта до помещения их в пробирки, что оказывало положительное влияние на рост микроклонов.

Проведенное ранее исследование также показало, что поливинилпирролидон можно добавлять в среду для уменьшения окисления и, как следствие, потемнения культивированных тканей [16; 26].

О.Ю. Гусева с коллегами проводили масштабную работу по оптимизации условий культивирования in vitro и ex vitro ювенильного материала дуба черешчатого [2]. Исследователи рекомендуют использовать материал от молодых саженцев, меристемные структуры, а также добавлять в состав питательной среды цитокинин 6-БАП, аденин и поли-винилпирролидон, в качестве сорбционного агента. Так как дуб является трудноразмно-жаемой культурой в условиях in vitro , а материал, взятый от многолетних дубов, обладает слабым ризогенным ответом, использование молодого материала и добавление сорбентов фенольных соединений позволяет получить качественные микроклоны дуба черешчатого в условиях клонального микроразмножения.

Однако поливинилпирролидон оказывает адсорбирующий эффект не со всеми видами растений. Исследование Prajapati и соавторов показало, что при добавлении данного полимера в питательную среду, ингибирующее действие на фенольные соединения не было оказано [20].

Sanyal с коллегами в результате своего исследования сообщили, что добавление таких антиоксидантов, как цистеин и нитрат серебра, улучшило прорастание нута in vitro после агроинокуляции [24]. Аналогичным образом в экспериментах Strosse было выявлено, что добавление цистеина к питательной среде уменьшает почернение экспланта и питательной среды в культуре ткани банана in vitro [22].

На основании проведенного анализа литературы можно выделить несколько часто применяемых в микроклональном размножении веществ, которые используют в качестве сорбентов фенольных соединений. На первом месте по применяемости, доступности и эффективности стоит древесный (активирован- ный) уголь. Его концентрации варьируют от 0,5 до 10 г на литр питательной среды, в основном используют 5 и 10 г/л.

Сорбционная способность углеродных материалов является главным критерием, который следует учитывать при производстве сорбента, поскольку сорбционная емкость производимого сорбента напрямую зависит от изначальной сорбционной способности сырья. Результаты подобных исследований А.А. Вой-таш и Ю.В. Берестневой уже описаны выше, поэтому они в общем смысле свидетельствуют о перспективе использования различных модификаций графита в качестве сорбентов фенольных соединений, выделяемых растениями в условиях клонального микроразмножения. Благодаря неоднородной пористой структуре, включающей как микропоры, так и мезо-или макропоры, ТРГ способен адсорбировать загрязняющие вещества как из раствора, так и с поверхности воды. Это указывает на целесообразность использования такого сорбента в качестве компонента питательной среды для микроклонального размножения растений in vitro .

Вторым по популярности и эффективности является поливинилпирролидон. Это водорастворимый полимер, составленный из мономерных единиц N-винилпирролидона, который входит в состав некоторых лекарственных препаратов, таких как «Энтеродез». Он оказывает дезинтоксикационное действие, заключающееся в способности к комплексообразованию. Механизм его действия заключается в способности активно связывать токсины, соответственно, он имеет высокую сорбционную способность по отношению к соединениям фенола, выделяемым микрорастениями в процессе развития в условиях in vitro , о чем свидетельствуют работы многих авторов.

Аналогичными свойствами обладает лекарственный препарат «Полисорб», основу которого составляет коллоидный диоксид кремния. Имеются немногочисленные данные о применении его в качестве компонента питательной среды, которые свидетельствуют о том, что данное вещество вовлечено в процесс снижения стресса у растений, а также повышает иммунитет организма. Ю.А. Зюзина и Е.В. Немцова исследовали влияние синтетического аморфного диоксида кремния на растения в условиях in vitro [3]. При добавлении в питательную среду препарата, содержащего диоксид кремния в концентрациях 50, 100 и 150 г/л, выявлено, что добавление данного вещества в концентрации 100 мг/л привело к увеличению коэффициента размножения эксплантов больше чем в 1,5 раза, а при концентрации 50 мг/л наблюдалась самая большая длина микропробегов. Полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии диоксида кремния на культивирование растений в условиях in vitro, а также оставляет перспективу для дальнейшего исследования влияния диоксида кремния в составе препарата «Полисорб» на развитие микроклонов.

Среди часто используемых веществ можно выделить следующие соединения: аскорбиновая и лимонная кислоты, нитрат серебра и хлорид ртути. Однако в составе питательной среды они чаще используются благодаря своим антиоксидантным свойствам, а не сорбционным способностям.

Заключение

Добавление в питательную среду таких сорбентов, как активированный уголь и его различные модификации, а также водорастворимого полимера поливинилпирролидона является необходимым для успешного получения микроклонов растений в условиях in vitro . Вышеперечисленные вещества успешно сорбируют фенольные соединения, препятствуя ингибированию регенерационного потенциала растений.