Состояние диффузной лимфоидной ткани тонкого кишечника мышей в условиях иммунодефицита и коррекции пептидным биорегулятором

На сегодня неблагоприятная экологическая ситуация, психоэмоциональные перегрузки, злоупотребление медикаментозными средствами, нарушения в питании и многие другие факторы приводят к росту числа заболеваний, сопровождающихся снижением естественной резистентности организма.

Одним из основных способов поддержания нормального функционирования иммунной системы и восстановления иммунитета при иммунодефицитных состояниях является применение иммуномодуляторов [1].

В качестве иммуномодуляторов эндогенного происхождения применяются иммуноре-гуляторные пептиды, полученные из органов иммунной системы.

В настоящее время доказана регулирующая роль пептидов в развитии большинства биологических процессов, начиная с биохимических реакций, заканчивая дифференцировкой и функциональной активностью различных клеток и систем организма. Изучение закономерностей пептидной регуляции позволяет рассматривать их как природные корректоры, направленность и сила которых зависит от исходного уровня конкретного биологического процесса.

Ранее авторами был получен пептидный биорегулятор, обладающий нейротропной, адаптогенной и иммуномодулирующей активностью [2, 3, 4]. В частности, было доказано, что пептидный биорегулятор, выделенный из тимуса свиней, восстанавливает показатели клеточного и гуморального иммунитета, функцию макрофагов при экспериментальной аза-тиоприновой иммуносупрессии. Также установлено, что биорегулятор сохраняет свой иммуномодулирующий эффект в составе фаршевого мясного продукта.

Крупнейшим отделом иммунной системы является лимфоидная ткань желудочнокишечного тракта, которая входит в состав кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ) [5].

Тонкая кишка, имея обширную пограничную поверхность, находится в постоянном контакте с многочисленными антигенами, поступающими алиментарным путем.

В связи с тесным контактом с антигенами в слизистой оболочке тонкой кишки развивается мощная лимфоидная ткань, образующая иммунокомпетентную систему, в которой происходят реакции клеточного типа, а также сенсибилизация лимфоцитов с последующей дифференцировкой в плазматические клетки, синтезирующие иммуноглобулины.

В структурной и функциональной деятельности иммунной системы слизистой оболочки тонкой кишки значительное место занимают пейеровы бляшки, одиночные лимфоидные узелки и диффузная лимфоидная ткань, которые составляют 70-80% всех иммунных клеток [6].

В связи с этим исследование механизма действия пептидного биорегулятора на периферическую лимфоидную ткань пищеварительной системы позволяет судить о реактивности иммунной системы при воздействии антигенов, поступающих извне.

Целью настоящего исследования явилось изучение функционального состояния диффузной лимфоидной ткани различных отделов тонкого кишечника мышей в условиях иммунодефицита, вызванного азатиоприном, и коррекции пептидным биорегулятором.

Материал и методы исследования

Для проведения экспериментальных исследований были использованы белые беспородные мыши-самцы весом 22-25 г. Животные были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой. Первая группа состояла из интактных животных. Во второй группе находились животные, получавшие перорально иммунодепрессант азатиоприн в дозе 50 мг/кг веса 1 раз в сутки в течение 5 дней. Третья группа животных после введения азатиоприна получала пептидный биорегулятор, вводимый аналогичным способом в дозе 0,1 мг/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней.

По окончании проводимых серий экспериментов животных умерщвляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом [7].

У животных всех экспериментальных групп выделяли проксимальный, средний и дистальный отделы тонкой кишки. Материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине с последующей стандартной спиртовой проводкой и заливкой в парафин по общепринятой методике [8]. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-6 мкм на микротоме, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Подсчет клеток проводили при помощи микроскопа Биомед 6 при увеличении объектива - 90 под масляной иммерсией по методу С.Б. Стефанова с использованием 25-узловой морфометрической сетки (с шагом 10 мкм), вмонтированной в окуляр (9х) микроскопа [9].

Полученные результаты систематизировали и подвергли статистической обработке с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

У животных интактной группы в проксимальном отделе тонкой кишки (табл., рис. 1) преобладали клетки лимфоидного ряда, из них 36,7% приходилось на средние лимфоциты. Количество малых лимфоцитов в 4,0 раза меньше, чем средних. Среди молодых форм клеток преобладали бластные формы, содержание которых было в 1,8 раза больше, чем больших лимфоцитов. Собственная пластинка слизистой оболочки содержала довольно большое ко- личество плазматических клеток 6,6%. Содержание нейтрофилов, макрофагов, митотиче-ски делящихся клеток составило соответственно 0,3, 1,4 и 1,6%. Содержание стромальных клеток (ретикулоцитов, фибробластов и фиброцитов) составляло в сумме 12,2%.

Рис. 1. Бруннеровы железы в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки интактной мыши (проксимальный отдел). Микрофотография. Фиксация – 10%-ный нейтральный формалин. Окраска гематоксилином-эозином (х 200)

Рис. 2. Собственная пластинка слизистой оболочки тонкой кишки мыши после введения азатиоприна. Отек слизистой оболочки и массовая деструкция клеточных элементов (проксимальный отдел).

Микрофотография. Фиксация – 10%-ный нейтральный формалин. Окраска гематоксилином-эозином (х 200)

Гистологическое исследование препаратов стенки тонкой кишки мышей, подвергшихся воздействию азатиоприна, свидетельствовало о наличии воспалительно-деструктивных процессов. Наблюдались отек слизистой оболочки, подслизистой основы и массовая деструкция клеточных элементов (рис. 2). Так, содержание деструктивно измененных и разрушенных клеток в проксимальном отделе тонкой кишки увеличилось в 4,9 раза по сравнению с контролем. Клеточный анализ диффузной лимфоидной ткани в собственной пластинке слизистой оболочки данного отдела тонкой кишки показал резкое уменьшение количества клеток лимфоидного ряда: количество больших лимфоцитов уменьшилось в 8,5 раза, средних лимфоцитов – в 2,7 раза по сравнению с контролем. Содержание плазматических клеток уменьшилось в 2,4 раза. Митотически делящиеся клетки в слизистой оболочке кишки в данной группе животных не выявлены. Для данной группы животных характерно значительное увеличение содержания нейтрофилов (в 11,7 раз). Как известно, среди всех клеточных элементов нейтрофилы первыми появляются в зоне острого воспаления. Кроме того, введение аза тиоприна вызывало увеличение содержания стромальных клеток: ретикулоцитов – в 1,7 раза и клеток фибробластического ряда – в 8,0 раз.

После введения пептидного биорегулятора у опытных мышей отмечалась перестройка клеточного состава лимфоидных клеток, которая характеризовалась для проксимального отдела тонкой кишки увеличением количества больших лимфоцитов в 16,0 раза (рис. 3), средних лимфоцитов – в 2,3 раза и плазматических клеток – в 1,7 раза (по сравнению со 2-й группой).

Важным показателем действия пептидного биорегулятора на лимфоидную ткань собственной пластинки слизистой оболочки кишки являлась стимуляция репродуктивной функции лимфоидных клеток. После введения пептидного биорегулятора появлялись клетки с картинами митозов (1,0%), которые отсутствовали в интактной и азатиоприновой группах. Под воздействием пептидного биорегулятора в проксимальном отделе уменьшилось количество деструктивно измененных клеток – в 1,7 раза (по сравнению со 2-й группой), но их содержание в 2,8 раза все же превосходило данный показатель у интактных животных. Введение пептидного биорегулятора способствовало нормализации относительного числа ретикулярных клеток и уменьшению клеток фибробластического ряда, содержание которых на фоне воздействия азатиоприна уменьшилось в 1,1 раза, но все еще существенно превосходило данный показатель у интактных животных.

Рис. 3. Собственная пластинка слизистой оболочки мыши, получавшей пептидный биорегулятор после введения азатиоприна (проксимальный отдел). Микрофотография. Фиксация – 10%-ный нейтральный формалин. Окраска гематоксилином-эозином (х 200)

На продольных гистологических срезах лимфоидной ткани среднего отдела тонкой кишки (табл.) у интактных мышей внутренняя поверхность стенки кишки неровная, на ней видно большое количество крипт. Количество клеток лимфоидного ряда (бласты, большие, средние и малые лимфоциты и плазматические клетки) в собственной пластинке слизистой оболочки составило 65,2%.

При гистологическом исследовании препаратов среднего отдела кишки мышей после введения азатиоприна отмечались признаки иммунодепрессивного состояния. После воздействия азатиоприна клетки лимфоидного ряда встречались гораздо реже, чем в контроле (от 65,2 до 34,2%). На гистологических срезах кишки в собственной пластинке слизистой оболочки содержание деструктивно измененных и разрушенных клеток увеличилось до 18,7%, что превысило контрольные показатели почти в 3 раза.

Цитологический анализ лимфоидной ткани среднего отдела кишки мышей, получавших после введения азатиоприна пептидный биорегулятор, свидетельствовал о том, что у этих животных наблюдалось отчетливое восстановление общего числа лимфоидных клеток от 34,2 до 53,6%. Содержание деструктивно измененных и разрушенных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки кишки данной группы экспериментальных животных снизилось по сравнению с показателями животных 2-й группы в 2,3 раза.

Таблица

Клеточный состав (в %) диффузной лимфоидной ткани собственной пластинки слизистой оболочки различных отделов тонкой кишки мышей в контроле и эксперименте (М±m)

Клетки/отдел	Интактные животные (контроль)			После введения азатиоприна			После введения азатиоприна и пептидного биорегулятора
	1-я группа			2-я группа			3-я группа
	Пр	Ср	Д	Пр	Ср	Д	Пр	Ср	Д
Ретикулоциты	10,4±1,3	8,5±0,9	7,3±0,8	17,8±0,9*	20,2±1,3	23,5±2,3*	14,3±1,2	10,7±0,6	6,2±0,7**
Бласты	12,3±0,4	5,4±3,1	0,7±0,1	16,7±0,3	12,3±2,7*	10,3±0,4*	11,7±2,3	6,1±1,8	3,9±0,3**
Большие лимфоциты	6,8±1,7	7,3±0,2	6,7±0,5	0,8±3,2*	0,2±0,1*	0,9±0,2*	12,8±2,6**	5,4±0,3**	9,4±0,7**
Средние лимфоциты	36,7±3,6	35,8±3,6	38,1±3,5	13,8±2,7*	11,5±2,2*	8,9±1,2*	31,5±1,4**	19,0±3,5**	11,6±1,3**
Малые лимфоциты	9,1±1,5	10,4±4,2	12,9±1,3	5,2±1,3	9,3±2,9*	11,3±1,7*	8,9±1,1	13,6±2,6**	12,5±1,2**
Плазмоциты	6,6±1,2	6,3±1,4	8,7±0,9	2,7±0,5*	0,9±0,1*	-	4,6±1,0**	9,5±2,1**	11,2±1,5
Нейтрофилы	0,3±0,1	0,4±0,1	0,2±0,3	3,5±0,9*	1,8±0,2	3,1±0,8	3,1±0,7	0,7±1,1	-
Макрофаги	1,4±0,2	1,2±0,6	1,1±0,2	1,9±0,3	0,3±0,1	-	0,7±0,2	4,2±0,9	6,2±1,7
Митотически делящиеся	1,6±0,3	1,5±0,2	-	-	-	-	1,0±0,1	0,8±1,0	0,9±0,1
Деструкции	3,4±1,7	6,4±1,8	9,5±1,8	16,5±1,5*	18,7±1,4*	23,5±2,2*	9,5±2,1**	8,2±2,5**	10,7±2,1**
Фиброциты	1,8±0,6	1,9±0,7	-	14,4±2,3*	7,3±0,8	6,8±1,4	13,0±2,0	7,5±1,3	8,3±0,3

Примечание. «-» в графах означает, что данные клетки не обнаружены; *, **  p<0,05 относи тельно 1-й или 2-й группы

Исследование цитоархитектоники диффузной лимфоидной ткани собственной пластинки слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки (см. табл.) у интактных мышей показало, что большая часть лимфоцитов из всех лимфоидных клеток относится к средним лимфоцитам – 38,1%. Малых лимфоцитов почти в 3 раза меньше (12,9%), чем средних. Среди молодых форм клеток преобладали большие лимфоциты, которые в 9,5 раза больше бластных форм клеток. В собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки у интактных мышей встречались плазматические клетки (8,7%), а также были видны деструктивно измененные клетки 9,5%.

Введение мышам азатиоприна приводило к усилению деструктивных процессов в лимфоидной ткани дистального отдела. Содержание деструктивно измененных и разрушенных клеток увеличилось после действия азатиоприна в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой. При этом общее содержание лимфоцитов снизилось от 67,1% в интактной группе до 31,4% в опыте. В собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки отмечалось значительное нарушение процессов созревания молодых форм: число больших лимфоцитов уменьшилось после действия азатиоприна в 7,4 раза, средних лимфоцитов – в 4,3 раза в сравнении с интактной группой. Количество плазматических клеток незначительное. Число ретикулоцитов увеличилось в 3,2 раза, и появились фиброциты (6,8%), которые не обнаруживались в интактной группе.

После введения пептидного биорегулятора в собственной пластинке слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки в 2 раза уменьшилось число деструктивно измененных и разрушенных клеток (по сравнению со 2-й группой) и почти достигло показателей интактной группы мышей. В 1,5 раза увеличилось общее содержание лимфоцитов (от 31,4 до 48,6%), однако число различных популяций лимфоцитов изменялось в разной степени. Так, доля средних и больших лимфоцитов возросла по сравнению с показателями 2-й группы в 1,3 и 10,4 раза соответственно. Число бластных форм, наоборот, уменьшилось в 2,6 раза. В диффузной лимфоидной ткани собственной пластинки слизистой оболочки кишки после действия пептидного биорегулятора появлялись также плазматические клетки – 11,2%.

В ходе проведенного исследования установлено, что введение азатиоприна способствовало уменьшению содержания клеток лимфоидного ряда в проксимальном отделе тонкой кишки в 1,9 раза, в среднем – 1,9 раза и в дистальном – 2,1 раза (по сравнению с контролем). Наибольшее повреждающее действие азатиоприна проявилось в дистальном отделе тонкой кишки. При коррекции иммунодефицита, вызванного азатиоприном, пептидным биорегулятором, содержание клеток лимфоидного ряда в проксимальном отделе увеличилось в 1,8 раза, в среднем – в 1,6 раза и в дистальном – в 1,5 раза (по сравнению со 2-й группой).

Полученные экспериментальные данные согласуются с результатами исследований Д.Г. Бильдуевой (2001) [10] и Г.П. Ламажаповой (2001) [11] о том, что нарушения периферической лимфоидной ткани пищеварительной системы (в собственной пластинке слизистой оболочки подвздошной и слепой кишки), вызванные применением цитостатика азатиоприна, подвергаются коррекции природными средствами – активной фракцией, полученной из селезенки, и липосомальными структурами, содержащими жир байкальской нерпы.

Таким образом, исследование морфофункционального состояния диффузной лимфоидной ткани в собственной пластинке слизистой оболочки различных отделов (проксимальный, средний, дистальный) тонкой кишки мышей в условиях азатиоприновой иммуносупрессии и коррекции пептидным биорегулятором, позволило выявить изменения, направленные на восстановление ее структуры.

Работа выполнена при поддержке гранта «Молодые ученые и аспиранты ВСГУТУ 2014».