Состояние Т- и В-лимфоцитов крови у морских свинок в разные физиологические периоды и на фоне применения Bacillus subtilis 3

В период беременности в организме матери происходит ряд морфофункциональных изменений, направленных преимущественно на создание условий для имплантации зародыша, роста и созревания плаценты, органогенеза, что необходимо для нормального роста и развития плода, сохранения и вынашивания его в течение всей беременности [1].

В организме матери при нормально протекающей беременности включаются дополнительные механизмы регуляции иммунологического статуса, в результате чего происходит угнетение клеточного и в меньшей степени гуморального звеньев иммунитета [1].

Супрессивное состояние клеточного звена иммунной системы, в частности, проявляется в снижении абсолютного и относительного количественного содержания Т- и В-лимфоцитов без существенного изменения их соотношения. Причиной дисбаланса субпопуляции Т-лимфоцитов является, возможно, временная инволюция тимуса, присутствующая в организме в период беременности [1]. Атрофию тимуса вызывает эстроген. Так, по данным В.А. Алешкина и др. (2004), у мышей инволюция тимуса усиливается в течение беременности, когда уровень эстрогена и прогестерона высокий [2].

В.И. Говалло (1987) также отмечает снижение массы тимуса у крыс к 14-суткам беременности в 3–4 раза по сравнению с исходной, а перед родами масса снижается еще больше [3]. В послеродовом периоде масса тимуса восстанавливается.

В связи с ослаблением иммунитета у самок в период беременности повышается риск возникновения инфекций бактериальной и вирусной этиологии, при этом в последние годы все более выявляется роль данных факторов в индукции нарушений механизмов регуляции иммунологических функций, направленных на сохранение аллогенного плода [1]. Такие на-

рушения могут касаться основных иммунокомпетентных клеток иммунной системы – Т- и В-лимфоцитов, а также фагоцитов, естественных киллеров, иммуноглобулинов и др.

Таким образом, на сегодняшний день весьма актуален вопрос коррекции иммунитета у беременных животных, а также поиск препаратов, обладающих свойствами, направленными на поддержание иммунитета в период беременности, но при этом не осложняющих течение самой беременности.

В последние годы отечественные и зарубежные биотехнологические фирмы перенесли свое внимание на разработку препаратов из спорообразующих бактерий рода Bacillus . Основными критериями использования этих бактерий в пробиотических препаратах является высокая антагонистическая активность и отсутствие видимых негативных эффектов при поступлении в организм животных и человека [4].

Пробиотические препараты на основе микроорганизмов рода Bacillus не только нормализуют кишечный биоценоз и профилактируют желудочно-кишечные болезни, но и влияют на многие органы и системы макроорганизма. Кроме того, помимо общего регуляторного воздействия на кишечный биоценоз, данные бактерии оказывают заметное стимулирующее влияние на иммунологический статус организма [5].

С учетом вышеизложенного мы исследовали значения относительного и абсолютного содержания Т- и В-лимфоцитов в крови экспериментальных животных в период беременности на фоне применения пробиотического штамма B. subtilis 3.

Цель и методы исследований

Цель работы – изучить состояние Т- и В-лимфоцитов крови у экспериментальных животных в разные физиологические периоды и на фоне применения B. subtilis 3, а также с помощью гистоморфологического метода выявить изменения, происходящие в органах центральной (тимус) и периферической (селезенка) иммунной системы.

Исследования проводили в НИЦ (войсковая часть 47051) ФБУ «33 ЦНИИИ Минобороны России» г. Екатеринбурга и на кафедре анатомии и гистологии Уральской государственной сельскохозяйственной академии.

Для проведения экспериментальных исследований были сформированы три группы животных по 5 особей в каждой. Первую группу составляли интактные (не беременные) морские свинки, вторую и третью – морские свинки (беременные) массой 800–850 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, при двенадцатичасовом световом режиме, температуре воздуха 22 ± 2,0ºС и свободном доступе к воде и корму. Работу с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [6].

Самкам третей (опытной) группы внутрижелудочно вводили суспензию клеток штамма B. subtilis 3 в концентрации 25 · 106 см3, самкам первой (контрольной) и второй (опытной) групп – 0,9% раствор хлорида натрия. Препарат давали животным во вторую половину беременности, один раз в сутки до кормления, в течение 14 дней.

По истечении срока наблюдения для постановки реакции розеткообразования (по Ю.В. Шигиной, 2007) у экспериментальных животных забирали кровь из ушной краевой вены в объеме 1 см3.

Метод определения количественного содержания Т- и В-лимфоцитов в реакции розет-кообразования основан на способности поверхностных рецепторов лимфоцитов связываться со специфическими маркерами. Т-лимфоциты несут рецепторы к эритроцитам барана и фиксируют их на своей поверхности, образуя розетку. В-лимфоциты несут рецепторы к третьему компоненту комплемента, который служит специфическим маркером в реакции розеткообра-зования с зимозаном, опсонизированным комплементом.

Для гистоморфологических исследований забирали тимус и селезенку. Материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина. Заливку в парафин осуществляли по общепринятой методике. Готовили парафиновые срезы толщиной 5–6 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводили под микроскопом «MICROS» с последующим фотографированием.

Результаты исследования

Одним из основных показателей оценки состояния иммунной системы является определение количества и функциональных свойств иммунокомпетентных клеток. Этим показателям отводится важная роль при нарушении функций иммунной системы. В свою очередь, изучение состояния Т- и В-лимфоцитов в онтогенезе в разные физиологические периоды позволяет судить о способности организма к иммунному ответу клеточного и гуморального типа.

Мы исследовали количество относительного и абсолютного содержания Т- и В-лимфо-цитов в крови беременных морских свинок при использовании пробиотического штамма B. subtilis 3. Результаты представлены на рис. 1 и 2.

% 80

69,8

60,6

45,8

45,8

60,2

55,4

• □    1-контрольная группа

• □    2-опытная группа (беременные)

• □    3-опытная группа (B.subtilis)

71,2

62,4

52,8

Лимфоциты

Т-лимфоциты

В-лимфоциты

в мазке

Рис. 1 . Относительное содержание Т- и В-лимфоцитов в крови экспериментальных животных

Изучение относительного и абсолютного содержания Т- и В-клеток в периферической крови экспериментальных животных в разные периоды физиологического состояния и на фоне применения B. subtilis 3 показало небольшие, но стабильные расхождения показателей относительных и абсолютных значений Т- и В-лимфоцитов в контрольной и опытных группах. Так, у животных второй группы относительное количество Т-клеток (рис. 1) несколько снизилось по сравнению с контролем и составило 55,4%, в то время как количество В-клеток не изменилось и составило 45,8%. У самок третьей группы показатели относительного количества Т- и В-лимфоцитов превосходят таковые у животных контрольной группы и составляют 62,4% и 52,8% соответственно.

Данные рис. 2 показывают, что при введении экспериментальным животным B. subtilis 3 в период беременности усиливается пролиферация Т- и В-лимфоцитов, что сказывается на абсолютных значениях количественного содержания этих клеток. Так, у животных третей опытной группы абсолютное количество Т-клеток составляет 1,4 · 106 кл/см3, что существенно выше этого показателя у морских свинок второй группы. Абсолютное содержание В-лимфоцитов у животных, получавших B. subtilis 3 в период беременности, соответствует этому показателю у животных контрольной группы и составляет 1,2 · 106 кл/см3.

Абсолютное содержание лимфоцитов в крови животных опытных групп несколько ниже данного показателя у контрольной группы, что по данным многих источников не является патологией для самок в период беременности.

Абсолютное содержание лимфоцитов

Абсолютное содержание

Т-лимфоцитов

Абсолютное содержание В-лимфоцитов

Рис. 2 . Абсолютное содержание Т- и В-лимфоцитов в крови экспериментальных животных

Анализ изменений в тканях на уровне их микроскопической организации позволяет раскрыть механизмы, которые происходят на тканевом и клеточном уровнях. Поэтому нами были проведены гистоморфологические исследования органов центральной (тимус) и периферической (селезенка) иммунной систем.

Рис. 3 . Тимус (B. subtilis 3). Инволюция тимуса.

Окраска гематоксилином и эозином. Увелич. 100×

При гистологических исследованиях тимуса беременных морских свинок третьей опытной группы была обнаружена инволюция долек тимуса (рис. 3, 4), то есть замещение их жировой тканью. В самих дольках отчетливо просматривается как мозговая, так и корковая зоны, которые и содержат большое количество Т-лимфоцитов.

Рис. 4 . Тимус (B. subtilis 3). Долька тимуса с тельцами Гассаля в жировой клетчатке. Окраска гематоксилином и эозином. Увелич. 400×

Среди жировой клетчатки обнаруживаются атрофированные дольки тимуса с малым количеством лимфоцитов и единичными тельцами Гассаля.

а

Рис. 5 . Тимус морской свинки (беременные): а – атрофированная долька тимуса при инволюции. Окраска гематоксилином и эозином. Увелич. 100×; б – жировые вакуоли в дольке тимуса.

Окраска гематоксилином и эозином. Увелич. 400× (см. также с. 43)

б

Рис. 5. Окончание

У животных второй опытной группы в тимусе также происходят инволютивные процессы (рис. 5, а), но в данном случае корковый и мозговой слои не просматриваются, а сама долька содержит большое количество жировых вакуолей (рис. 5, б).

Рис. 6. Селезенка морской свинки (B. subtilis 3).

Усиление рисунка артерии и выраженный рисунок центра размножения фолликула.

Окраска гематоксилином и эозином.

Увелич. 200×

При гистологическом исследовании селезенки беременных морских свинок, получавших B. subtilis 3, выявлено интенсивное размножение фолликулов селезенки. Все структурные элементы органа хорошо выражены. В некоторых фолликулах селезенки наблюдается образование нового фолликула (рис. 6), что может свидетельствовать об усиленной иммунной реакции организма животных.

Рис. 7 . Слившиеся фолликулы в селезенке морской свинки (беременная). Окраска гематоксилином и эозином. Увелич. 200×

У самок, не получавших B. subtilis 3 в период беременности, в селезенке были отмечены изменения, характерные для иммунодефицитных состояний. В органе выявлены очаги слияния фолликулов (рис. 7), это своего рода компенсаторно-приспособительная реакция организма самки на беременность, а также редукция некоторых фолликулов (рис. 8) и утолщение капсулы селезенки.

Рис. 8 . Селезенка морской свинки (беременная). Редуцированный фолликул селезенки. Окраска гематоксилином и эозином. Увелич. 200×

Выводы

Проведенные исследования показали, что микроорганизмы B. subtilis 3 обладают иммуностимулирующими свойствами и оказывают тем самым определенное влияние на иммунокомпетентные клетки крови самок в период беременности.

Гистоморфологическое исследование центральных и периферических органов иммунной системы экспериментальных животных в период беременности и на фоне применения B. subtilis 3 показало, что применение данного штамма в период беременности не вызывает патологических изменений в органах иммунной системы, улучшает процесс формирования элементов иммунокомпетентных клеток и тормозит раннюю инволюцию органов иммунной системы. Это, в свою очередь, приводит к более активному формированию клеточного иммунитета.