Совместимые вещества штамма Halomonas sp. SMB31, синтезируемые в ответ на осмотический стресс

Род Halomonas был предложен R.H. Vreeland с соавторами [1980] для нового вида H. elongata, объединяющего восемь штаммов грамотрицатель-ных бактерий, растущих в полноценной среде с казаминовыми кислотами в присутствии 32%-ной морской соли. Позднее, благодаря молекулярногенетическому анализу последовательностей гена 16S рРНК, было пересмотрено таксономическое положение представителей родов Deleya и Halovibrio, а также видов Paracoccus halodenitrificans и Volcaniella eurihalina, с целью объединения с видами рода Halomonas [Mellado et al., 1995; Dobson,

Franzmann, 1996]. В настоящее время род Halomonas включает 94 вида и является фенотипически и генетически гетерогенным [Mellado et al., 1995; Dobson, Franzmann, 1996; Arahal et al., 2002]. На основе филогенетического анализа последовательностей генов 16S рРНК, 23S рРНК, gyr B и rpo D в системе рода Halomonas можно выделить две, значительно удаленные друг от друга группы ( группа 1 или Halomonas sensu stricto и группа 2) [Arahal et al., 2002; de la Haba et al., 2012]. Неоднократно высказывалось мнение о том, что виды группы 2 могут представлять новый род

[Arahal et al., 2002; de la Haba et al., 2012]. Кроме того, некоторые виды, среди которых H. pantelleriensis и H. taeanensis , очевидно, не попадают ни в одну из перечисленных групп, так как имеют низкий уровень родственного сходства с представителями какой-либо из них [Arahal et al., 2002; de la Haba et al., 2012].

Бактерии рода Halomonas выделены преимущественно из почвенных и водных экосистем, характеризующихся высокими концентрациями солей и/или щелочными рН [Arahal et al., 2001]. Для выживания в условиях высокого осмотического давления внешней среды клетки накапливают низкомолекулярные высокорастворимые в воде органические соединения, которые не нарушают метаболизм – совместимые вещества [Roberts, 2005]. Таковыми являются сахара, многоатомные спирты, аминокислоты, бетаины, эктоины или их производные. В настоящее время известны работы, посвященные исследованию механизмов осмоадаптации бактерий рода Halo-monas на примере видов филогенетической группы Halomonas sensu stricto (H. elongata, H. halophila и H. halmophila), Н. boliviensis (филогенетическая группа 2) и вида H. pantelleriensis, не относящегося ни к одной из филогенетических групп рода [Wohlfarth et al., 1990; Ono et al., 1998; Romano et al., 2001; Van-Thuoc et al., 2010].

Между тем имеющиеся данные могут не в полной мере раскрывать особенности адаптации бактерий рода Halomonas к высокой осмолярности среды. Ввиду вышесказанного, цель настоящего исследования – изучение физиологии и совместимых соединений штамма Halomonas sp. SMB31, на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, филогенетически близкородственного виду H. taeanensis (уровень сходства 99.8%) [Ананьина, 2007, Корсакова и др., 2013], в сравнении с ранее исследованными видами рода Halomonas.

Материалы и методы исследования

Изучение кинетики роста штамма в зависимости от концентрации хлорида натрия (см. табл. 1) проводили при культивировании в 100 мл минеральной среды Раймонда (МСР) [Розанова, Назина, 1982], содержащей 1 г/л глюкозы (ОАО «Дальхимфарм», Россия), в колбах объёмом 250 мл на орбитальном шейкере УВМТ-12-250 («Элион», Россия) при 100 об/мин. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре BioSpecmini TCC-240A (Shimadzu corporation, Япония) при 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Дополнительно способность к росту в присутствии разных концентраций хлорида натрия (1-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30%-ного) и без него изучали, культивируя исследуемый штамм на агаризо-ванной полноценной среде Раймонда (ПСР) [Plotnikova et al., 2011] при 28°С. Рост оценивали спустя две недели по наличию колоний.

Таблица 1

Рост Halomonas sp. SMB31 в присутствии разных концентраций хлорида натрия

Среда культивирования	Концентр ация хлори да натрия в среде культивирования, %
	0	1	5	10	15	20	25	30
Агаризованная ПСР*	-	+	+	+	+	+	+	+
Жидкая МСР**	0.15 (98)	0.79 (24)	1.07 (24)	1.04 (30)	0.89 (80)	0.59 (98)	0.11 (98)	н.о.

Примечания: *Рост культуры оценивался по появлению колоний размером не менее 1 мм на агаризованной среде ( - – нет роста, + – рост). **Рост культуры оценивался путем измерения оптической плотности среды культивирования (исходная ОП 540 = 0.11–0.15), в скобках указано время культивирования (часы), н.о. – не

определяли .

Для исследования совместимых веществ бактериальную культуру выращивали в минеральной среде Раймонда, содержащей 1-, 5-, 10-, 15%-ный NaCl и 1 г/л глюкозы, при 28°С до стационарной фазы роста. В экспериментах инокулятом (1% об./об.) служила культура, выросшая до фазы замедленного роста при 28°С в минеральной среде Раймонда, содержащей 5%-ный NaCl и 1 г/л глюкозы. Экстракцию органических соединений из клеток проводили 80%-ным раствором этанола, следуя процедуре, разработанной Bernard с соавторами [1993]. 20 мкл каждого образца анализировали изократической высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на приборе Shimadzu prominence LC-20AD (Shimadzu corporation, Япония), снабженном UV/VIS- детектором CPD-20A (Shimadzu corporation, Япония) и колонкой Сепарон SGX 100 NH2, 4.6×150 мм, 5 мкм (Dr. Maisch GmbH, Германия), согласно методике, описанной в статье [Garcia-Estepa et al., 2006]. Идентификацию соединений проводили при сравнении времени удерживания с коммерческими препаратами эктоина и гидроксиэктоина (Fluka, Германия). Количество совместимых веществ рассчитывали на 1 мг сухого веса биомассы. Сухой вес определяли согласно опубликованной методике [Fuhrer et al., 2005]. Дополнительно состав этанольных экстрактов клеток исследовали методом спектроскопии ЯМР 1H. Для этого высушенный осадок растворяли в 0.5 мл D2O (ООО «Астра-хим», Россия) и записывали спектр при 30°С на приборе Bruker Avance Neo 400 (Bruker

Corporation, США), при частоте 400 МГц.

Химические сдвиги (δ) указаны в м.д., относительно сигнала метильной группы эктоина (2.24 м.д.). Идентификацию сигналов в спектре проводили сравнением с литературными данными, со спектрами аутентичных образцов и путем добавления веществ к пробе. Количественные измерения проводили методом внутреннего стандарта, в качестве которого использовали малеиновую кислоту (СН-группы около 6.35 м.д.).

Результаты и их обсуждение

Физиологическая характеристика штамма

Исследуемый штамм Halomonas sp. SMB31 был способен к росту на агаризованной полноценной среде Раймонда (с триптоном и дрожжевым экстрактом) в присутствии хлорида натрия до 30%, образуя на поверхности единичные колонии диаметром 1 мм, и не рос без соли (табл. 1). Штамм H. elongata 1H9^T (=ATCC 33173^T=CECT 4279^T= DSM 2581^T) в питательном бульоне был способен к росту без внесения морской соли и в ее присутствии до 32% [Vreeland et al., 1980]. В среде HM [Ventosa et al., 1982] с протеозо-пептоном, дрожжевым экстрактом и глюкозой штаммы H. elongata CECT 4279^T и H. boliviensis LC1^T росли без морской соли и в ее присутствии до 20 и 25%, соответственно [Mata et al., 2002; Quillaguaman et al., 2004]. Оптимальный рост H. elongata CECT 4279^T находился в широком диапазоне (3–8%) морской соли, а у штамма H. boliviensis LC1^T при 5%-ном NaCl. Верхним пределом диапазона роста штаммов H. halophila CCM 3662^T (=FS-7^T) и H. halmophila ATCC 19717^T (=CCM 2833^T= NCMB 1971^T) служила концентрация морской соли – 25%, для роста было необходимо 2 и 3%, соответственно [Mata et al., 2002]. Оптимум роста обоих штаммов наблюдался при концентрации 7.5% соли. H. pantelleriensis AAP^T был способен расти при концентрации хлорида натрия от 1.25 до 15%, с оптимумом при 10%-ном NaCl [Romano et al., 1996]. Таким образом, анализ имеющейся в литературе информации о физиологии штаммов, являвшихся объектами исследований процессов осмоадаптации, выявил, что все штаммы, за исключением H. pantelleriensis AAP^T, способны к росту в широком диапазоне солености среды культивирования, некоторые штаммы росли без соли, но оптимум роста всех культур находился в пределах 0.5-2.5М NaCl.

В 1984 г. Imhoff и Rodriguez-Valera отметили положительную корреляцию внутриклеточного количества бетаина от концентрации соли в среде культивирования, содержащей дрожжевой экстракт – источник глицинбетаина. Vreeland с соав- торами [1983] описал похожую зависимость для аминокислотного пула вида H. elongata, выращенного в минеральной среде с аланином. Поэтому дальнейшее культивирование штамма Halomonas sp. SMB31 проводили в минеральной среде Раймонда и единственным органическим соединением – глюкозой, которая служила источником углерода и энергии. Для роста исследуемого штамма Halomonas sp. SMB31 сохранилась потребность в присутствии как минимум 1%-ного NaCl, максимальное значение оптической плотности и наименее короткая фаза адаптации были отмечены при 5%-ном NaCl (табл. 1). Верхняя граница концентрации хлорида натрия, при которой возможен рост, снизилась до 20%. На примере бактерий Vibrio costicola NRC 508, H. halodenitrificans NRC 509 и H. elongata 1H9T было показано, что при культивировании на среде с дрожжевым экстрактом накопление экзогенного бетаина сопровождалось повышением солеустойчивости бактерий [Forsyth, Kushner, 1970; Vreeland, Martin, 1980].

Спектр органических соединений, накапливаемых клетками штамма Halomonas sp. SMB31

Как показало исследование этанольных экстрактов клеток методом спектроскопии ЯМР ¹Н, применяемым для анализа смесей органических соединений разных химических классов, преобладающим соединением являлся эктоин (рисунок; табл. 2). Минорным компонентом была глутаминовая кислота (рисунок; табл. 2). В этанольных экстрактах клеток, выросших в присутствии 10- и 15%-ного NaCl, помимо перечисленных выше компонентов, был выявлен гидроксиэктоин (рисунок, б). Согласно литературным данным, в ЯМР-спектрах клеточных экстрактов бактерий видов H. elongata , H. halophila , H. halmophila , H. pantelleriensis, культивированных в присутствии 10% или 1.8М NaCl при оптимальной для роста температуре, были обнаружены сигналы эктоина, глутаминовой кислоты и гидроксиэктоина, а в экстрактах H. halmophila были выявлены сигналы аланина [Ono et al., 1998; Romano et al., 2001; Wohlfarth et al., 1990]. Кроме того, было отмечено, что виды группы Halomonas sensu stricto отличались относительными пропорциями минорных компонентов пула совместимых веществ [Wohlfarth et al., 1990]. Увеличение концентрации хлорида натрия в среде культивирования с 5 до 15% приводило к снижению доли глутаминовой кислоты (с 12.2 до 0.5%), и увеличению доли эктоинов за счет накопления гидроксиэктоина в клетках штамма Halomonas sp. SMB31 (табл. 2). Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными для представителя вида H. pantelleriensis [Romano et al., 2001].

а                                                    б

5,м.д.                                                             6,м.д.

¹Н ЯМР-спектры этанольных экстрактов клеток штамма Halomonas sp. SMB31 , культивированного в минеральной среде Раймонда с глюкозой в присутствии 5% (а) и 10% (б) NaCl при температуре 28°С:

Э - эктоин, Глу - глутаминовая кислота, Г - гидроксиэктоин

Таблица 2

Отношение интегральных интенсивностей сигналов протонов соединений к интегральной интенсивности сигналов всех протонов в спектрах ЯМР ¹Н штамма Halomonas sp. SMB31 (%)

Концентрация NaCl в среде культивирования, %	Эктоин	Гидроксиэктоин	Глутаминовая кислота	Неидентифицированные соединения
5	78.1	0.0	12.2	9.7
10	82.5	2.2	6.0	9.3
15	67.9	14.4	0.5	17.2

Влияние условий культивированияна биосинтез эктоинов

Установлено, что повышение концентрации хлористого натрия с 5 до 15% привело к возрастанию внутриклеточного количества эктоина и гидроксиэктоина у исследуемого штамма (табл. 3). Несмотря на рост бактериальной культуры в присутствии 1%-ного NaCl (табл. 1), количество эктоина в клетках было крайне мало (табл. 3). На при-

Таблица 3

Внутриклеточное количество эктоинов* (мкмоль/мг сухого веса биомассы) штамма Halomonas sp. SMB31

Концентрация NaCl в среде культивирования, %	Cтационарная фаза, 28°С		log -Фаза, 28°С
	Эктоин	Гидроксиэктоин	Эктоин	Гидроксиэктоин
1	0.0018	0.0	н.о.**	н.о.
5	0.34±0.15	0.0	0.11±0.01	0.0
10	0.60±0.10	0.02	н.о.	н.о.
15	0.58±0.03	0.14±0.04	н.о.	н.о.

Примечание. *определение количества в клеточных экстрактах осуществляли методом ВЭЖХ, стандартное отклонение рассчитывали для значений выше 0.1 мкмоль/мг сухого веса биомассы, ** - не определяли.

Подобная закономерность была отмечена для штамма Halomonas sp. SPCl [Cummings, Gilmour, 1995], что согласуется с результатами анализа промоторной области ectABC-оперона штамма H. elongata DSM 2581T, в которой выше стартового мере штаммов H. elongata KS3, H. elongata ATCC 33173T, H. boliviensis LC1T было показано, что накопление в клетках эктоина осмозависимо [Wohlfarth et al., 1990; Ono et al., 1998; Van-Thuoc et al., 2010]. Внутриклеточное количество эктоина штамма Halomonas sp. SMB31 зависело от стадии роста (табл. 3). Так, внутриклеточный пул эктоина был в три раза больше на стационарной стадии роста, чем на стадии логарифмического роста (табл. 3).

кодона ect A-гена расположены области связывания с вегетативным сигма-фактром и сигма-фактором стационарной фазы роста [Schwibbert et al., 2011].

Гидроксиэктоин в клетках исследуемого штамма Halomonas sp. SMB31 накапливался при культивировании с 10% NaCl и более, при этом его внутриклеточное количество имело положительную зависимость от солености среды. Аккумуляция гидроксиэктоина в клетках бактерий рода Halomonas (разных видов) индуцируется при высоких концентрациях хлорида натрия в среде культивирования: H. elongata и H. boliviensis – при 10% NaCl [Wohlfarth et al., 1990; Ono et al., 1998; Guzman et al., 2009], H. pantelleriensis – 1.8М NaCl [Romano et al., 2001]. Таким образом, гидроксиэктоин накапливается при концентрациях хлорида натрия, превышающих таковые оптимума роста. Van-Thuoc с соавторами [2010] предположил, что биосинтез гидроксиэктоина регулируется внутриклеточным количеством эктоина. Высокая внутриклеточная концентрация эктоина может приводить к активации эктоингидроксилазы, фермента, катализирующего превращение эктоина в гидроксиэктоин, и/или может ингибировать эктоинсинтазу (фермент, катализирующий синтез эктоина из N-γ-ацетил-1-2,4-диаминобутирата).

Заключение

В настоящее время осмоадаптация исследована у отдельных представителей рода Halomonas, которые отличаются по потребности ионов натрия для роста. Практически все исследованные культуры, за исключением вида H. pantelleriensis [Romano et al., 2001], были способны к росту в полноценных средах при концентрации солей, близких к насыщенным (30%-ного NaCl). Ранее исследованные галомонады отнесены к группе умеренногалофильных организмов, оптимум роста которых находится в диапазоне 5–10% соли. Для штамма Halomonas sp. SMB31 (близкородственного виду H. taeanensis) в полноценной среде Раймонда верхним пределом диапазона роста служила концентрация хлорида натрия 30%, а оптимум роста наблюдался при 5%-ном NaCl. Исследование механизмов осмоадаптации Halomonas sp. SMB31 выявило их сходство с таковыми ранее исследованных видов рода Halomonas. В пуле совместимых соединений бактерий рода Halomonas преобладал эктоин, его количество возрастало с увеличением соли в среде культивирования и зависело от фазы роста [Wohlfarth et al., 1990; Cummings, Gilmour, 1995; Ono et al., 1998; Van-Thuoc et al., 2010]. При концентрации хлорида натрия в среде культивирования выше максимальных значений диапазона оптимума роста в клетках исследованного нами штамма Halomonas sp. SMB31 и штамма H. elongata ATCC 33173T [Wohlfarth et al., 1990] накапливался гидроксиэктоин. Полученные результаты могут указывать на высокую консервативность механизмов адаптации к высокой осмо- лярности среды у умеренногалофильных бактерий рода Halomonas.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Министерства образования и науки Пермского края в рамках научного проекта № 17-44-590178.